菌落总数与大肠菌群数测定

主要内容菌落总数测定大肠菌群测定MPN法原理（拓展内容）本文档共38页；当前第1页；编辑于星期六\16点46分菌落总数测定掌握菌落总数测定方法实验原理 不同稀释度的样品，营养琼脂培养基，36℃，48h（水产品30℃，72h），菌落数本文档共38页；当前第2页；编辑于星期六\16点46分菌落总数测定器材与试剂：样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培养基，1ml吸管，培养皿本文档共38页；当前第3页；编辑于星期六\16点46分菌落总数测定本文档共38页；当前第4页；编辑于星期六\16点46分倾注培养本文档共38页；当前第5页；编辑于星期六\16点46分培养结果本文档共38页；当前第6页；编辑于星期六\16点46分菌落总数测定实验步骤

5.菌落计数：肉眼观察，可用放大镜，可标记必要时分区计数，菌落成片者作废计算方法某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值选择菌落数在30-300之间的稀释度（1）仅有一个稀释度在此范围：菌落数×稀释倍数本文档共38页；当前第7页；编辑于星期六\16点46分菌落总数测定计算方法：（2）有两个稀释度在30-300之间菌落数之比>2，选较小值菌落数之比<2，取平均值（3）所有稀释度均>300

取稀释倍数最大者（4）所有稀释度均<30

取稀释倍数最小者（5）没有任何稀释度在30-300之间选最接近该范围者结果单位：CFU/ml（g）本文档共38页；当前第8页；编辑于星期六\16点46分菌落总数测定注意事项：

1.无菌操作

2.标记

3.何时更换吸管

4.吸吹混匀

5.琼脂培养基保温

6.安全常识本文档共38页；当前第9页；编辑于星期六\16点46分大肠菌群数测定实验目的实验原理

36℃，48h，产气（小倒管）三步法：初发酵、复发酵器材与试剂样品、无菌生理盐水、LST肉汤，BGLB肉汤

1ml吸管、10ml吸管、试管、小倒管本文档共38页；当前第10页；编辑于星期六\16点46分初发酵器材与试剂样品、225ml无菌生理盐水、9ml无菌生理盐水、双料LST肉汤，单料LST肉汤，10ml吸管、1ml吸管、吸球本文档共38页；当前第11页；编辑于星期六\16点46分大肠菌群数测定实验步骤：

1.初发酵

本文档共38页；当前第12页；编辑于星期六\16点46分本文档共38页；当前第13页；编辑于星期六\16点46分本文档共38页；当前第14页；编辑于星期六\16点46分吸取样品方法本文档共38页；当前第15页；编辑于星期六\16点46分加注样品本文档共38页；当前第16页；编辑于星期六\16点46分初发酵结果右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。本文档共38页；当前第17页；编辑于星期六\16点46分实验步骤

3.复发酵（1）选取产气试管（2）接种至10mlBGLB肉汤中（3）培养：36℃，48h

（4）观察指标：若产气则报告大肠菌群阳性。本文档共38页；当前第18页；编辑于星期六\16点46分大肠菌群数测定实验步骤

2.分离培养（1）制备伊红美蓝平板：

45℃，无菌，倾注，15ml

（2）选产酸产气的发酵管（3）接种至伊红美蓝平板分区划线法（4）培养：36℃，48h本文档共38页；当前第19页；编辑于星期六\16点46分分离培养器材与试剂初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基本文档共38页；当前第20页；编辑于星期六\16点46分分区划线法第一区划线灭菌接种环第二区划线灭菌接种环第三区划线灭菌接种环本文档共38页；当前第21页；编辑于星期六\16点46分分区划线法操作要点

1.划下一个区前必须灭菌接种环

2.划线时接种环同平板呈30-40°角

3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线

4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动本文档共38页；当前第22页；编辑于星期六\16点46分大肠菌群数测定实验步骤

2.分离培养：

（5）菌落特征：深紫黑色、有金属光泽紫黑色、无或略有金属光泽淡紫红色、中心颜色深（6）革兰染色、镜检：选特征菌落本文档共38页；当前第23页；编辑于星期六\16点46分革兰染色法器材与试剂结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸本文档共38页；当前第24页；编辑于星期六\16点46分革兰染色法涂片：接种环，挑取菌落，生理盐水一滴，涂匀热固定：通过火焰若干次初染：结晶紫一滴，1min，水洗媒染：卢戈碘液一滴，1min，水洗脱色：95%乙醇，30s或至无色为止复染：复红一滴，30s本文档共38页；当前第25页；编辑于星期六\16点46分涂片本文档共38页；当前第26页；编辑于星期六\16点46分热固定本文档共38页；当前第27页；编辑于星期六\16点46分初染本文档共38页；当前第28页；编辑于星期六\16点46分媒染本文档共38页；当前第29页；编辑于星期六\16点46分脱色本文档共38页；当前第30页；编辑于星期六\16点46分复染本文档共38页；当前第31页；编辑于星期六\16点46分革兰氏染色阴性革兰氏染色阳性革兰染色法本文档共38页；当前第32页；编辑于星期六\16点46分复发酵器材与试剂培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管本文档共38页；当前第33页；编辑于星期六\16点46分大肠菌群数测定实验步骤

3.复发酵（1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落1-3个（2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液（3）培养：37℃，24h

（4）观察指标：产酸，产气本文档共38页；当前第34页；编辑于星期六\16点46分液体接种本文档共38页；当前第35页；编辑于星期六\16点46分复发酵复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生本文档共38页；当前第36页；编辑于星期六\16点46分大肠菌群数测定注意事项：

1.无菌操作

2.吸管使用

3.洗去染液的方法

4.显微镜保养

5.