第四章第二节分光光度计的操作与使用

第四章第二节分光光度计的操作与使用第一页，共五十九页，编辑于2023年，星期五可见分光光度法

可见分光光度法是利用测量有色物质对某一单色光的吸收程度来进行测定的。可见分光光度计主要部件光源单色器样品室检测器显示第二页，共五十九页，编辑于2023年，星期五1．光源：2．单色器：包括狭缝、准直镜、色散元件棱镜——对不同波长的光折射率不同色散元件分出光波长不等距光栅——衍射和干涉分出光波长等距钨灯或卤钨灯——可见光源350~1000nm氢灯或氘灯——紫外光源200~360nm第三页，共五十九页，编辑于2023年，星期五3．吸收池：玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4．检测器：将光信号转变为电信号的装置5．记录装置：讯号处理和显示系统光电池光电管光电倍增管二极管阵列检测器第四页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

可见分光光度法

一、显色反应及显色条件的选择

1.显色反应将试样中被测组分转化成有色化合物的反应。第五页，共五十九页，编辑于2023年，星期五2.显色剂在显色反应中与被测组分生成有色化合物的试剂。无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢、氨水等。有机显色剂：如磺基水杨酸、邻菲罗啉、结晶紫、孔雀绿等；第六页，共五十九页，编辑于2023年，星期五3、选择显色反应时应考虑的因素：1）灵敏度高2）选择性高3）生成物稳定4）显色剂在测定波长处无明显吸收，与有色物最大吸收波长之差（对比度），应满足

>60nm。第七页，共五十九页，编辑于2023年，星期五4、显色条件的选择（1）显色剂用量：固定待测组分的浓度和其他条件只改变显色剂浓度测定吸光度。做A-显色剂剂用量cR的关系曲线如图。选择曲线变化平坦处作为显色条件。（2）溶液的pH值固定待测组分的浓度和其他条件只改变溶液的pH值测定吸光度。做A-pH曲线，选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。吸光度与显色剂用量关系曲线cRcRcRAAA第八页，共五十九页，编辑于2023年，星期五（3）显色温度固定待测组分的浓度和其他条件只改变反应温度，测定吸光度。做A-T曲线，选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的温度范围。（4）显色时间及稳定时间固定待测组分的浓度和其他条件只改变反应的时间，测定吸光度。做A-t曲线，选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的时间范围。pHA图12-9吸光度与pH关系曲线第九页，共五十九页，编辑于2023年，星期五（5）、干扰的消除1.加入掩蔽剂选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。例：测定Ti4＋，加入H3PO4掩蔽剂使Fe3+(黄色)成为［Fe(PO４)2］3-(无色)，消除Fe3+的干扰。2.分离干扰离子采用适当的分离方法预先除去干扰物质。第十页，共五十九页，编辑于2023年，星期五3.选择适当的显色反应条件

通过控制适宜的显色条件，消除干扰组分的影响。4.选择适宜的波长避开干扰物的最大吸收，配制适当的参比液，消除干扰组分的影响。5.提高显色反应的选择性利用被测物能形成三元络合物的特点，提高显色反应的选择性。第十一页，共五十九页，编辑于2023年，星期五三、吸光度测定条件的选择1.选择适当的入射波长一般应该选择λmax为入射光波长。但如果λmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。

吸光度测定条件的选择曲线A为钴络合物的吸收曲线曲线B为显色剂的吸收曲线第十二页，共五十九页，编辑于2023年，星期五2.选择适当的参比溶液

注：采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰。第十三页，共五十九页，编辑于2023年，星期五参比溶液的选择一般遵循以下原则：溶液代号在测定波长处有无吸收试液1无无干扰有干扰有显色剂2无有无有其它所加试剂3无有无有（或无）参比溶液2+3或（水)2+31(1+掩蔽)后+2+3第十四页，共五十九页，编辑于2023年，星期五3.控制适宜的吸光度读数范围选A=0.2~0.8第十五页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

1.当光从一种介质传播到另一种介质中时，下列（）保持不变。A.波长

C.速度

B.频率

D.方向

很遗憾，您答错了答对了！点此进入下一题很遗憾，您答错了很遗憾，您答错了课堂练习第十六页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

2.光的粒子性表现在下述（）性质上。B.频率

A.能量

C.波长

D.波数很遗憾，您答错了答对了！点此进入下一题很遗憾，您答错了很遗憾，您答错了课堂练习第十七页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

3.下列（）光谱属于分子吸收光谱。B.分子磷光光谱A.分子荧光光谱D.紫外-可见光谱C.分子化学光谱很遗憾，您答错了答对了！点此进入下一题很遗憾，您答错了很遗憾，您答错了课堂练习第十八页，共五十九页，编辑于2023年，星期五4.紫外-可见光谱的产生是由于分子在吸收紫外-可见光后，发生（）类型的跃迁。A.振动能级跃迁B.转动能级跃迁

C.电子能级跃迁

D.以上答案都不是

很遗憾，您答错了答对了！点此进入下一题很遗憾，您答错了很遗憾，您答错了课堂练习第十九页，共五十九页，编辑于2023年，星期五1．朗伯-比耳定律的物理意义是什么？写出其数学表达式。2．什么是吸收曲线？什么是标准曲线？它们有何实际意义？3．显色反应如何选择？4．吸光度测量条件如何选择？5．光度分析法中，参比溶液应如何选择？答案问答题第二十页，共五十九页，编辑于2023年，星期五1.答：当一束平行的单色光通过液层厚度为b的有色溶液时，溶液的吸光度A与液层的厚度b和溶液的浓度c成正比。即A=lg(I0/I)=εbc第二十一页，共五十九页，编辑于2023年，星期五3.答：以入射光波长作横坐标，用分光光度计测量每一波长下物质对光的吸光度作纵坐标所绘制的曲线，称为吸收曲线。其作用是：选择入射光波长，在此波长下测量吸光度，则分析的灵敏度最高。因此，吸收曲线是吸光光度法中选择测定波长的重要依据。在某特定波长下，用分光光度计测量一系列不同浓度的标准溶液的吸光度，然后以浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标所绘制的曲线，称为标准曲线（亦称工作曲线）。它是作为待测物质定量分析的依据。如果在相同条件下测得待测试液的吸光度值，从标准曲线上就可查得待测试液的浓度，这就是标准曲线法。第二十二页，共五十九页，编辑于2023年，星期五4.答：显色反应的选择原则是：（1）选择生成的有色物质（MR）的ε较大的显色反应；（2）显色剂（R）在测定波长处无吸收

，即ε尽可能小；（3）反应生成的有色物质（MR）的组成要恒定，化学性质稳定。5.答：吸光度测量条件包括三个主要方面：

（1）入射光波长的选择：

入射光的波长应根据吸收曲线选择λmax为宜。因在此波长处ε值最大，使测定具有较高的灵敏度。（2）参比溶液的选择：

在吸光度的测量中，由于比色皿的反射以及溶剂、试剂等对光的吸收，使得第二十三页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

测得的吸光度值不能真实地反映待测物质对光的吸收

，也就不能真实地反映待测物质的浓度。为了校正上述影响需要正确选择参比溶液。通过调节仪器使参比溶液的吸光度为零（A=0）,或透光度T=100%。借此消除上述影响。

（3）吸光度读数范围的选择

吸光度值太大或太小时，读数波动所引起的吸光度读数误差较大，为了减小读数误差，应使测量的吸光度值控制在A=0.15～1.0（或透光度T在75%～10%）范围之内。可以采用以下措施：（a）控制溶液的浓度，如改变试样的称量，或改变溶液的稀释度等；（b）选择不同厚度的比色皿，以改变光程的长度。第二十四页，共五十九页，编辑于2023年，星期五6.答：参比溶液的选择原则如下：

（1）若仅待测物（M）与显色剂（R）的反应产物（MR）有吸收，可用蒸馏水作参比溶液。（2）若待测物（M）无吸收

，而显色剂（R）或其它试剂（R′）有吸收

，则用不加试样的空白溶液作参比溶液。

（3）若试样中的其它组分有吸收（待测物M之外的组分，如N），但不与显色剂反应，当显色剂无吸收时，可用试样溶液作参比溶液；当显色剂有吸收时，可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，以此溶液作参比溶液。

总之，选择参比溶液的原则是：应使测得的试液的吸光度能真正反映待测物的浓度。第二十五页，共五十九页，编辑于2023年，星期五紫外-可见分光光度法的应用定性分析定量分析应用光谱对照特征数据比较吸光度比值的比较单一组分的测定多组分的测定第二十六页，共五十九页，编辑于2023年，星期五吸光系数吸光系数k的物理意义为：液层厚度为1cm的单位浓度溶液的吸光度，它表示物质对特定波长光的吸收能力。一个物质在一定条件下的吸光系数为定值。通常有两种表示方法：

摩尔吸光系数ε

吸光系数

吸光系数k

第二十七页，共五十九页，编辑于2023年，星期五物理意义是指样品浓度为1mol·L-1的溶液置于1cm样品池中，在一定波长下测得的吸光度值。量纲为L·mol-1·cm-1

。ε104102中强吸收弱吸收强吸收（一）摩尔吸光系数ε第二十八页，共五十九页，编辑于2023年，星期五（二）吸光系数a物理意义是指溶液浓度在1g/L，液层厚度为1cm时，在一定波长下的吸光度值。量纲为L·g-1·cm-1。

吸光系数和摩尔吸光系数有如下关系：

a

=ε/M（M为摩尔质量）第二十九页，共五十九页，编辑于2023年，星期五例4-1用氯霉素（分子量为323.15）纯品配制100mL含2.00mg的溶液，使用1.00cm的吸收池，在波长为278nm处测得其透射率为24.3%，试计算氯霉素在278nm波长处的摩尔吸光系数和比吸光系数。解：已知λ=278nmM=323.15g/mol

c=2.00×10-2

T=24.3%

（三）、吸光系数第三十页，共五十九页，编辑于2023年，星期五(四)、吸收光谱

第三十一页，共五十九页，编辑于2023年，星期五不同浓度KMnO4溶液的吸收光谱（五）、吸收光谱第三十二页，共五十九页，编辑于2023年，星期五一、定性分析

1.光谱对照同样条件下测定待测物和标准物的吸收光谱，如果两者吸收光谱一样，可认为是同一物质。如无标准物，也可比较标准谱图集里的光谱。第三十三页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

2.特征数据比较最大吸收波长λmax和吸光系数，是用于定性鉴别的主要光谱数据。

3.吸光度比值的比较

有些物质的光谱上有几个吸收峰，可在不同的吸收峰（谷）处测得吸光度的比值作为鉴别的依据。

一、定性分析第三十四页，共五十九页，编辑于2023年，星期五二、定量分析定量分析的依据是

1.单一组分的测定（1）吸光系数法查得吸光系数后根据吸光度求得样品浓度

第三十五页，共五十九页，编辑于2023年，星期五例4-5已知维生素B12在361nm处的吸光系数为20.7。精密称取样品30.0mg，加水溶解后稀释至1000mL，在该波长处用1.00cm吸收池测定溶液的吸光度为0.618，计算样品溶液中维生素B12的质量分数。解：已知A=0.618a=20.7l=1.00cm由A=alc样品中维生素B12含量为

二、定量分析第三十六页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

1.单一组分的测定（2）标准比对法相同条件下，分别配制待测溶液X和标准溶液S，并分别测定吸光度。根据郎伯-比尔定律，可写出二、定量分析第三十七页，共五十九页，编辑于2023年，星期五例4-6为测定维生素B12原料药含量，准确称取试样25.0mg，用蒸馏水溶解后，定量转移至1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度后，摇匀。另称取同样重量的B12标准品，用蒸馏水溶解后，稀释至1000ml，摇匀。在361nm波长处，用1cm比色皿分别测得样品溶液和标准品溶液的吸光度分别为0.512和0.518。求试样中B12的百分含量。解：已知Ax

=0.512As

=0.518两溶液配制、稀释方法一致二、定量分析第三十八页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

1.单一组分的测定（3）标准曲线法用标准曲线法测铁的浓度为例：①配一系列浓度的标准铁溶液，依次测定吸光度②作c-A图，即标准曲线三磺基水杨酸合铁配合物波长420nm③将待测溶液吸光度AX代入标准曲线，读出浓度二、定量分析第三十九页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

2.多组分的测定当溶液内有两个及以上组分并需测得各自含量时，就是多组分的测定。（1）吸收光谱互不重叠（2）吸收光谱部分重叠（3）吸收光谱相互重叠二、定量分析第四十页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

2.多组分的测定（1）吸收光谱互不重叠此种情况下可以按单组分测定的方法分别求得各个组分浓度二、定量分析第四十一页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

2.多组分的测定（2）吸收光谱部分重叠例如右图，可先在无干扰处λ2求得a的浓度，再求得b的浓度

依次求得a和b的浓度λ2处：λ1处：二、定量分析第四十二页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

2.多组分的测定（3）吸收光谱相互重叠解方程组法,如右图λ1处：λ2处：12解方程组可得：二、定量分析第四十三页，共五十九页，编辑于2023年，星期五2.多组分的测定（3）吸收光谱相互重叠等吸收双波长消去法例如右图，选取两个波长，a物质在这两波长处的吸光度相同λ1处：λ2处：二、定量分析第四十四页，共五十九页，编辑于2023年，星期五2.多组分的测定

λ1处：λ2处：两式相减，得：在这两个波长处两组分总的吸光度的差值(⊿A)只和其中一个组分的浓度有关，可以依次求出各组分浓度。二、定量分析第四十五页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

1.指出下列哪种是紫外-可见分光光度计常用的光源？()

B.激光器

A.硅碳棒

D.卤钨灯

C.空心阴极灯

很遗憾，您答错了答对了！点此进入下一题很遗憾，您答错了很遗憾，您答错了课堂练习第四十六页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

2.在一定波长处，用2.0cm吸收池测得某样品溶液的百分比透光率为71%，若改用3.0cm吸收池时，该溶液的吸光度A为（）

A=-LgT=0.15A.0.10

B.0.37

C.0.22

D.0.45

很遗憾，您答错了答对了！点此进入下一题很遗憾，您答错了很遗憾，您答错了课堂练习第四十七页，共五十九页，编辑于2023年，星期五3.常见紫外-可见发光光度计的波长范围为（）A.200～400nmB.400～750nmC.200～750nmD.400～1000nm很遗憾，您答错了答对了！点此进入下一题很遗憾，您答错了很遗憾，您答错了课堂练习第四十八页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

4.

测定一系列浓度相近的样品溶液时，常选择的测定方法为（）B.标准对比法

A.标准曲线法

C.绝对法

D.解方程计算

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5.

在分光光度法中，运用朗伯－比尔定律进行定量分析采用的入射光为（）A.白光C.可见光B.单色光

D.紫外光很遗憾，您答错了答对了！点此进入下一题很遗憾，您答错了很遗憾，您答错了课堂练习第五十页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

6.许多化合物的吸收曲线表明，它们的最大吸收常常位于200─400nm之间，对这一光谱区应选用的光源为()

B.能斯特灯

A.氘灯或氢灯

C.钨灯

D.空心阴极灯灯

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7.双波长分光光度计和单波长分光光度计的主要区别是（）B.单色器的个数A.光源的个数D.单色器和吸收池的个数C.吸收池的个数很遗憾，您答错了答对了！点此进入下一题很遗憾，您答错了很遗憾，您答错了课堂练习第五十二页，共五十九页，编辑于2023年，星期五

8.符合朗伯-比尔定律的有色溶液稀释时，其最大吸收峰的波长位置（）A.向长波方向移动

B.向短波方向移动

C.不移动，但最大吸收峰强度降低

D.不移动，但最大吸收峰强度增大

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