第六章色谱分析导论

第六章色谱分析导论第一页，共五十六页，编辑于2023年，星期五基本要求:1.理解混合物中各组分在色谱柱内得到分离的原因;2.理解柱效率的物理意义及其计算方法;3.理解速率理论方程对实际分离的指导意义;4.掌握分离度的计算及影响分离度的重要色谱参数.第二页，共五十六页，编辑于2023年，星期五色谱法定义:色谱法或色谱分析（chromatography）也称之为色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。色谱的产生：1903年，俄国植物学家MikhailTswett最先发明。他采用填充有固体CaCO3细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物(叶绿素和叶黄素chlorophylls&xanthophylls)加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被分离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱Chromatography(希腊语中“chromat”=color;“graphein”=graph)。植物色素分离见图示

6.1色谱法及其分类第三页，共五十六页，编辑于2023年，星期五图示固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚

色带第四页，共五十六页，编辑于2023年，星期五色谱的发展史1940年提出液液分配色谱法（Liquid－LiquidPartitionChromatography），即固定相是吸附在硅胶上的水，流动相是某种有机溶剂。1941年Martin和Syngee提出用气体代替液体作流动相的可能性，11年之后James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法（Gas－LiquidChromatography），因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（TLC）得以实际应用，而在1956年Stahl开发出薄层色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。续前第五页，共五十六页，编辑于2023年，星期五1957年Golay开创了开管柱气相色谱法（Open－TubularColumnChromatography），习惯上称为毛细管柱气相色谱法（CapillaryColumnChromatography）。60年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现了高效液相色谱（HPLC）第六页，共五十六页，编辑于2023年，星期五80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，但在90年代后未得到较广泛的应用。而在80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳（CZE），在90年代得到广泛的发展和应用。90年代后期集HPLC和CZE优点的毛细管电色谱得到迅速发展。21世纪色谱科学将在生命科学等前沿科学领域发挥不可代替的重要作用。第七页，共五十六页，编辑于2023年，星期五

1.按固定相外形分：柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱（薄层色谱和纸色谱)。2.按组份在固定相上的分离机理分：

吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同；

分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同；

离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同；

凝胶色谱（尺寸排阻色谱）:不同尺寸分子在固定相上的渗透作用。色谱分类方法第八页，共五十六页，编辑于2023年，星期五

3.按两相状态分第九页，共五十六页，编辑于2023年，星期五6.2色谱流出曲线（色谱图）

色谱流出曲线图第十页，共五十六页，编辑于2023年，星期五色谱术语：1）基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线，S/N大的、稳定的基线为水平直线。2）峰高：色谱峰顶点与基线的距离。3）保留值(Retentionvalue,R)

a.死时间(Deadtime,t0)：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。据t0可求出流动相平均流速

第十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期五

b.保留时间tr：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间t0和组份在固定相中滞留的时间。c.调整保留时间tr`：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即

第十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期五由于时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。d.死体积V0：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。勿略后两项可得到：其中，Fco为柱出口的载气流速（mL/min)，其值为：F0-检测器出口流速；Tr-室温；Tc-柱温；p0-大气压；pw-室温时水蒸汽压。＊注:对液相色谱Fco为柱内流动相体积流速（mL/min)，不需要进行校正。

第十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期五

e.保留体积Vr：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。

f.调整保留体积：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。

g.相对保留值r2,1：组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。第十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期五注意：r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！具体做法：固定一个色谱峰为标准s，然后再求其它峰i对标准峰的相对保留值，此时以表示：>1,又称选择因子(Selectivityfactor)。第十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期五h.净保留体积

经压力修正的调整保留体积，即：其中式中:j--色谱柱进口和出口之间的压力梯度校正系数。pi--色谱柱进口压力；po--色谱柱出口压力。i.比保留体积把净保留体积进一步校正到单位质量固定液和273K时的保留体积，如下式：

式中:Ws--固定液的质量。第十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期五

j.区域宽度：用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。通常有三种表示方法：标准偏差：0.607倍峰宽处的一半。半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.354峰底宽W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。W=4第十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期五色谱流出曲线的意义：

色谱峰数=样品中单组份的最少个数；

色谱保留值——定性依据；

色谱峰高或面积——定量依据；

色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标；

色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。第十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期五6.3色谱法基本原理两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的热力学性质决定。每个组份峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程动力学性质决定。因此，研究、解释色谱分离行为应从热力学和动力学两方面进行。第十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期五一、描述分配过程的参数1、分配系数(Distributionconstant,K)：描述组份在固定相和流动相间的分配过程或吸附-脱附过程的参数，称为分配系数。K只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。第二十页，共五十六页，编辑于2023年，星期五2.分配比(Retentionfactororcapacityfactor,k)：在一定温度和压力下，组份在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比，称为分配比。它反映了组分在柱中的迁移速率。又称保留因子。其中VmV0，Vs为固定相体积。第二十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期五分配比k的求算：1）组分滞留因子：2）又，3）因此，第二十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期五3.K与k的关系：

称为相比率，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。4.

选择因子

：色谱柱对A、B两组分的选择因子定义如下：A为先流出的组分，B为后流出的组分。第二十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期五注意：K或k反映的是某一组分在两相间的分配；而是反映两组分间的分离情况！当两组分K或k相同时，=1时，两组分不能分开；当两组分K或k相差越大时，越大，分离得越好。两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。和k是计算色谱柱分离效能的重要参数！第二十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期五二、峰间距、峰形状和峰宽的理论描述1.塔板理论（Platetheory)1952年，Martin等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。

第二十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期五塔板理论假定：1）塔板之间不连续；2）塔板之间无分子扩散；3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H；4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。当塔板数n较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数n>50时，峰形接近正态分布。第二十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期五由塔板理论假设导引出一个描述色谱流出曲线的数学表示式：式中c:色谱流出曲线上任意一点样品的浓度；n:理论塔板数；

m:溶质的质量；VR:溶质的保留体积，即从进样到色谱峰极大点出现时通入色谱柱载气的体积；V:在色谱流出曲线上任意一点的保留体积。

第二十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期五

根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计算塔板数n的公式，用以评价一根柱子的柱效。由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称理论塔板数：若柱长为L，则每块理论塔板高度H为

由上述两式知道，理论塔板数n越多、理论塔板高度H越小、色谱峰越窄，则柱效越高。但上述两式包含死时间t0，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。通常以有效塔板数neff和有效塔板高度Heff表示：第二十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期五有关塔板理论的说明：1）说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等；2）应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命。塔板理论的贡献:描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程、导出流出曲线的数学模型、解释了流出曲线形状和位置、提出了计算和评价柱效的参数。

塔板理论的不足:该理论是在理想情况下导出的，未考虑分子扩散因素、其它动力学因素对柱内传质的影响。因此它不能解释：

峰形为什么会扩张？影响柱效的动力学因素是什么？第二十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期五

1956年，荷兰化学工程师vanDeemter提出了色谱过程动力学速率理论：吸收了塔板理论中的板高H概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而给出了vanDeemter方程：u为流动相线速度；A，B，C为常数，其中A—分别表示涡流扩散系数；B—分子扩散系数；C—传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。2.速率理论（Ratetheory）第三十页，共五十六页，编辑于2023年，星期五1）涡流扩散项(Multipathterm,A)在填充柱中，由于受到固定相颗粒的阻碍，组份在迁移过程中随流动相不断改变方向，形成紊乱的“涡流”：从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性——同一组分运行路线长短不同——流出时间不同——峰形展宽。展宽程度以A表示：A=2dp其中dp—填充物平均直径；—填充不规则因子。

可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小A，提高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。流动方向第三十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期五2）分子扩散项(Longitudinaldiffusionterm,B/u)纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。当样品被注入色谱柱时，它呈“塞子”状分布。随着流动相的推进，“塞子”因浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为B=2D—称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况；D—组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以Dg或Dm表示；讨论：分子量大的组分，Dg小，即B小;

Dg

随柱温升高而增加，随柱压降低而减小；流动相分子量大，Dg小，即B小；

u增加，组份停留时间短，纵向扩散小；（B/u）

对于液相色谱，因Dm较小，B项可勿略。球状颗粒；大分子量流动相；适当增加流速；短柱；低温。第三十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期五3）传质阻力项(Mass-transferterm,Cu)因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，二者传质过程不完全相同。下面分别作讨论。a）气液色谱：传质阻力项C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl。流动相固液界面固定液组分分子ClCg第三十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期五讨论：

※减小填充颗粒直径dp；

※采用分子量小的流动相，使Dg增加；

※减小液膜厚度df，Cl下降。但此时k又减小。因此，当保持固定液含量不变时，可通过增加固定液载体的比表面来降低df。但比表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。※增加柱温，可增加Dl，但k值也减小，为保持合适Cl值，应控制柱温。第三十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期五b）液液色谱：传质阻力项C包括流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数Cs。

sm第三十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期五讨论：

流动相传质阻力包括两方面：流动相中的传质阻力Cm、滞留的流动相传质阻力Csm。分别与填充物大小dp、扩散系数(Dm)、微孔大小及其数量等有关。因此，降低流动相传质阻力的方法有：细颗粒固定相、增加组分在固定相和流动相中的扩散系数D、适当降低线速度、短柱。固定相传质阻力与液膜厚度df、保留因子k和扩散系数Ds等有关。因此，降低固定相传质阻力的方法有：减小液膜厚度df，Cl下降。但此时k又减小。当保持固定液含量不变时，可通过增加固定液载体的比表面来降低df。但比表面过大又会因吸附过强使峰拖尾。

第三十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期五4）流速u由vanDeemter方程H=A+B/u+Cu知道：当u一定时，仅在A、B、C较小时，H较小，柱效较高；反之则柱效较低，色谱峰将展宽。以u对H作图，可得H-u曲线（如图），从该曲线得到：板高，H(cm)HminA+B/u+CuCmuCsuAB/u第三十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期五涡流扩散项A与流速u无关；低流速区(u小)，B/u大，分子扩散项占主导，此时选择分子量大的气体如N2和Ar为载气，可减小扩散，提高柱效；高流速区(u大)，Cu大，传质阻力项占主导，此时选择分子量小的气体如H2和He为载气，可增加扩散系数，提高柱效；曲线的最低点对应最佳线速uopt()下的最小板高Hmin()；LC的Hmin和uopt均比GC的小一个数量级，即在LC中，较低流速可获得较大的柱效。第三十八页，共五十六页，编辑于2023年，星期五5）固定相颗粒大小对板高的影响实验表明，颗粒越细，板高越小，受线速影响越小。即，在HPLC分析中采用细粒作固定相的理论根据！但颗粒细导致柱流速慢，当采用高压技术，才能实现HPLC的分析要求。

上面分别介绍了影响色谱分离的基本原理以及影响柱效的各种因素，但是如何从总体上定量描述色谱分离效能？如何将各种影响因素对分离的影响定量地表述出来呢？板高,H(cm)第三十九页，共五十六页，编辑于2023年，星期五6.4分离度及色谱分离方程一、分离度(Resolution,R)同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：

利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度R。R越大，相邻组分分离越好。当R=1.5时，分离程度可达99.7%，因此R=1.5通常用作是否分开的判据。第四十页，共五十六页，编辑于2023年，星期五R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间t,min第四十一页，共五十六页，编辑于2023年，星期五二、色谱分离方程R的定义并未反映影响分离度的各种因素。也就是说，R未与影响其大小的因素：柱效n、选择因子和保留因子k联系起来。对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数K相差小，可合理假设k1k2=k，W1W2=W。因此可导出R与n（neff）、和k的关系：第四十二页，共五十六页，编辑于2023年，星期五附,具体推导过程如下：第四十三页，共五十六页，编辑于2023年，星期五有关色谱方程的讨论：1）分离度R与柱效的关系分离度R与理论塔板数n有关，即R受动力学性质的影响。对具一定相对保留值的物质对，R与有效塔板数neff有关，说明neff可正确代表柱效能。由色谱方程可得：

因此可通过增加柱长提高分离度。然而，分析时间也相应增加，且峰宽也展宽！为提高柱效，用减小塔板高度H的方法比增加柱长更有效。第四十四页，共五十六页，编辑于2023年，星期五2）分离度R与保留因子的关系越大，柱选择性越好，对分离有利。的微小变化可引起R较大改变。如，当从1.01增加至1.10(增加9%)时，R则增加9倍(但>1.5,R增加不大)。改变的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。3）分离度R与分配比k的关系k增加，分离度R增加，但当k>10，则R的增加不明显。通常k在2~10之间。改变k的方法有：适当增加柱温(GC)、改变流动相性质和组成(LC)以及固定相含量。第四十五页，共五十六页，编辑于2023年，星期五70%CH3OH+30H2O60%CH3OH+40H2O50%CH3OH+50H2O40%CH3OH+60H2O溶剂(流动相)组成对色谱分离的影响(梯度淋洗)1：9,10-蒽醌；2：2-甲基-9,10-蒽醌；3：2-乙基-9,10-蒽醌4：1,4-二甲基-9,10-蒽醌；5：2-特丁基甲基-9,10-蒽醌；改变组成使k最佳第四十六页，共五十六页，编辑于2023年，星期五色谱分离中的问题

由于分析物组成复杂，以某一组成的流动相可能使部分待测物得到好的分离，但同时出使其它待测物的分离不令人满意！实际工作中采用程序升温（GC）和梯度淋洗（LC）来解决这个问题。第四十七页，共五十六页，编辑于2023年，星期五三、分析时间t分析时间通常指最后一个组分出峰的时间。由以下三式：得到可见，分析时间与