GSH对低温胁迫下枇杷幼果叶绿体AsA-GSH循环代谢的影响

PAGE本科生毕业设计论文GSH对低温胁迫下枇杷幼果叶绿体AsA-GSH循环代谢的影响

原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文（设计），是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文（设计）不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本论文（设计）的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学生签名：年月日指导声明本人指导的同学的毕业论文（设计）题目大小、难度适当，且符合该同学所学专业的培养目标的要求。本人在指导过程中，通过网上文献搜索及文献比对等方式，对其毕业论文（设计）内容进行了检查，未发现抄袭现象，特此声明。指导教师签名：年月日

目录TOC\o"1-2"\h\z\u0引言 21材料与方法 21.1供试材料 21.2主要试剂与仪器 21.3测定项目与方法 21.4数据分析 32结果与分析 32.1GSH对低温胁迫下枇杷幼果叶绿体GSH含量的影响 32.2GSH对低温胁迫下枇杷幼果叶绿体AsA含量的影响 32.3GSH对低温胁迫下枇杷幼果叶绿体中MDHAR活性的影响 33讨论 34结论 4致谢 4参考文献 4附录 5PAGE1GSH对低温胁迫下枇杷幼果叶绿体AsA-GSH循环代谢的影响黄秀琴（环境与生命科学系指导教师：吴敏生）摘要：探讨GSH在提高枇杷(EriobotryajaponicaLindl.)幼果抗寒性方面的应用。以3年生“早钟6号”枇杷(EriobotryajaponicaLindl.cv.ZaozhongNO.6)容器苗为试材，研究不同质量浓度谷胱甘肽(GSH)处理对﹣3℃条件下枇杷幼果叶绿体AsA-GSH循环代谢的影响及其在抗低温胁迫中的作用。低温胁迫下枇杷幼果叶绿体抗氧化剂还原型谷胱甘肽(GSH)和抗坏血酸(AsA)含量下降,多种重要酶的活性受到不同程度的抑制。采用GSH处理可显著提高低温胁迫下枇杷幼果叶绿体GSH等的活性，促进AsA-GSH循环，在枇杷幼果抵抗低温胁迫中发挥作用关键词：叶绿体;还原型谷胱甘肽(GSH);低温胁迫;AsA-GSH循环代谢Abstract:Thepaperstudiedtheapplicationofreducedglutathione(GSH)inincreasingthechillingresistanceabilitiesofyoungloquat(EriobotryajaponicaLindl.cv.ZaozhongNO.6)fruits.Thecontainerseedlingofthree-year-oldloquatweretreatedwith100,300and500mg·L-1ofGSH.ThestudywastoinvestigatetheeffectsofexogenousGSHonAsA-GSHcirculationmetabolisminchloroplastsofyoungloquatfruitsunderlowtemperaturestress,anditseffectsontheresistancetolowtemperaturestress.TheresultsshowedthatthecontentsofGSHandascorbicacid(AsA)inchloroplastsdecreasedwhiletheactivitiesofsomeimportantenzymesalsodecreasedwhentheyoungloquatfruitswereunderlowtemperaturestress.Thetreatmentwith100mg·L-1ofGSHonyoungloquatfruitscouldsignificantlyimprovetheGSH,AsAcontentsandAPX,GR,MDHARactivities.Furthermore,thetreatmentpromotedAsA-GSHcirculationmetabolism,andimprovedtheabilityoffreeradicalstoscavengeinchloroplasts.TheresultsdemonstratedthatexogenousGSHplayedaroleinthelowtemperaturestressresistanceofyoungloquatfruits.Keywords:chloroplast;reducedglutathione(GSH);lowtemperaturestrees;AsA-GSHcirculationmetabolism PAGE5

0引言枇杷（EriobotryaJaponicaLindl）是福建省的地方名特优果品。[1]枇杷品种为耐寒性较差的热带型品种，低温胁迫是热带型枇杷品种生长的关键限制性因子。近年我国南方山地枇杷产区都有不同程度的冻害发生。热带型枇杷在我国现有枇杷栽培面积和产量中占有较大的比重，研究当前枇杷生产上存在枇杷幼果受冻的突出问题以减少因冻害造成的损失具有一定的实际意义和理论价值。谷胱甘肽(GSH)是植物体内普遍存在的还原性物质，在防御自由基对膜脂的过氧化中起到重要作用。相关研究表明，生物膜是低温胁迫对植物造成伤害的原初作用部位和反应部位，临界低温下膜上类脂发生由液晶相向凝胶相的转变，并引发如膜透性增大和膜结合酶活化能增高等继发反应，导致组织不可逆伤害的发生。[2,3]关于GSH对低温胁迫下枇杷幼果叶绿体AsA-GSH循环代谢影响的研究未见相关报道。本试验拟采用不同质量浓度的外源GSH处理低温胁迫下枇杷幼果，探讨外源GSH处理对叶绿体AsA-GSH循环代谢的影响，以期为GSH在提高枇杷幼果抗寒性方面的应用提供理论依据。1材料与方法1.1供试材料以“早钟6号”三年生枇杷容器苗为试材，选取长势一致、无病虫害与损伤、生长正常、花后60d的枇杷容器苗(已疏果)，以100、300、400和500mg·L-1等不同质量浓度的GSH(分别在表中标记为T1、T2、T3与T4)溶液100mL均匀喷施于叶面和幼果，以无低温胁迫喷清水处理为对照1(CK1)，以低温胁迫加喷清水处理为对照2(CK2)。每个处理5株。将经GSH处理和CK2容器苗置于人工气候室-3℃低温下处理6h，后于室温下平衡10h，迅速取下幼果经液氮速冻后保存于-40℃低温冰箱，待测相关指标，见表表1试验条件GSH质量浓度（mg·L-1）溶液标记对照1对照2备注100T1………300T2………400T3………500T4………注：以无低温胁迫喷清水处理为对照1(CK1)，以低温胁迫加喷清水处理为对照2(CK2)1.2主要试剂与仪器本试验使用的牛血清白蛋白(Albumin，FractionV）、磷酸缓冲液、三氯乙酸(TCA)、考马斯亮蓝G-250、30%过氧化氢、L-半胱氨酸、β-巯基乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)、Tris-HCl缓冲液、还原型谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(AsA)和NaCl等试剂为国产分析纯或生物级试剂。主要仪器有：MDF-U4086S型超低温冰箱(日本三洋)、5415R型Eppendorf冷冻离心机(德国产)和Eppendorf移液枪(德国产)等。1.3测定项目与方法1.3.1叶绿体的制备参考崔彬彬等(2006)的方法提取完整叶绿体[10]。以缓冲液(含0.05mol·L-1的磷酸缓冲液PBS，5.0mmol·L-1的EDTA，pH7.8)悬浮叶绿体，用于测定APX、GR、MDHAR和DHAR活性以及GSH和AsA含量。1.3.2GSH和AsA含量测定取叶绿体悬浮液1.0mL，加1.5mL蒸馏水和5%三氯乙酸溶液2.5mL混匀，于6600rpm离心10min，上清液定容至5.0mL，用于测定GSH含量，GSH含量测定参照Ellman(1959)的方法。取叶绿体悬浮液1.0mL于2600rpm离心10min，沉淀用于制备10%叶绿体匀浆液(叶绿体重量/生理盐水体积为1:9)，用于测定AsA含量，AsA的测定参照陈建勋等(2002)的方法。[4]1.4数据分析上述测定均设3次独立试验，每次3个重复。测定所得数据经Duncan’s新复极差法进行方差分析,检验差异显著性。2结果与分析2.1GSH对低温胁迫下枇杷幼果叶绿体GSH含量的影响谷胱甘肽是植物体内重要的抗氧化剂与氧化还原势的调节剂。由图1可知，经GSH处理的枇杷幼果叶绿体中GSH含量均高于CK2，差异达显著水平(P＜0.05)。说明GSH处理可提高低温胁迫下枇杷幼果叶绿体中GSH的含量，其中以100mg·L-1的GSH处理的枇杷幼果叶绿体GSH含量极显著高于CK1和CK2以及300mg·L-1和500mg·L-1的GSH处理(P＜0.01)。CK1枇杷幼果叶绿体的GSH含量高于CK2，差异达显著水平(P＜0.05＝，表明低温胁迫降低了枇杷幼果叶绿体GSH含量。2.2GSH对低温胁迫下枇杷幼果叶绿体AsA含量的影响AsA在APX的参与下清除细胞内的H2O2，减轻低温胁迫等逆境条件下引发的膜脂的过氧化伤害。经GSH处理的幼果叶绿体AsA含量均高于CK2，差异达显著水平(P＜0.05)。其中以100mg·L-1的GSH所处理的幼果叶绿体中AsA含量最高，但300mg·L-1和500mg·L-1的GSH所处理的枇杷幼果叶绿体中AsA含量低于CK1(图2)。CK1:无低温胁迫的0mg.L-1GSH处理；CK2:经低温胁迫和0mg.L-1GSH处理；T1:经低温胁迫和100mg.L-1GSH处理;T2:经低温胁迫和300mg.L-1GSH处理;T3:经低温胁迫和500mg.L-1GSH处理;下同。

2.3GSH对低温胁迫下枇杷幼果叶绿体中MDHAR活性的影响细胞内MDHA在MDHAR的作用下被还原成AsA，使AsA得以再生，推动AsA-GSH的循环代谢。……3讨论细胞内活性氧自由基的积累使膜脂质过氧化作用加强,是低温胁迫导致细胞伤害与死亡的重要机制之一，胞内H2O2在正常情况下可通过Halliwell-Asada途径清除[5]。此反应所产生的氧化型谷胱甘肽(GSSG)又可在谷胱甘肽还原酶(GR)的催化下被还原成GSH；另一部分MDHA则被单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR，EC)还原为AsA。[18]GSH作为AsA-GSH循环代谢的重要组成部分参与或直接清除胞内活性氧自由基,谷胱甘肽还原酶(GR，EC)的活性影响到胞内GSH库的水平，植物对环境胁迫的抵抗能力与该酶活性的变化密切相关。[2,7,8,9]本试验研究发现，100mg·L-1的外源GSH处理可显著提高低温胁迫下枇杷幼果叶绿体GSH含量和GR活力(P＜0.05)；较高浓度(300和500mg·L-1)的外源GSH处理对GR活力表现出强烈的抑制作用(即低于CK2)，但它们的GSH含量却高于CK2，这可能与叶绿体吸收外源GSH导致其含量上升继而对GR起抑制作用有关。[18]4结论叶绿体中高含量的GSH能促进叶绿体AsA-GSH循环，使叶绿体内AsA含量增加以及APX、MDHAR和GR活性相应提高[19]。本研究结果表明，采用100mg·L-1的外源GSH处理可提高低温胁迫下枇杷幼果叶绿体中抗氧化剂GSH和AsA含量以及APX、GR和MDHAR的活性，这些非酶抗氧化物质与酶之间的协调作用，促进AsA-GSH循环，叶绿体清除自由基的能力增强，维持叶绿体内较低的膜脂过氧化水平，可能与提高枇杷幼果的抗寒性有关。致谢：我的毕业论文试验让吴老师花费大量的心血，在此感谢吴敏生教授在试验方面的耐心指导与帮助；同时我还要感谢李露露参考文献：[1]陈建勋,王晓峰.植物生理学[M].3版.广州:华南理工大学出版社,2002:122-126.[2]宋松泉,程红焱,龙春林.种子生物学研究指南[M].北京:科学出版社,2005.[3]华春,王仁雷,刘友良.外源GSH对盐胁迫下水稻叶绿体活性氧清除系统的影响[J].植物生理与分子生物学学报,2003,29(5):415-420.[4]鲁丽丽,刘耕,李君,等.GSH对二色补血草盐害缓冲机理的研究[D].福州:福建农林大学果树研究所,2010.[5]林琳,姜微波,曹健康,等.谷胱甘肽处理对采后鸭梨果实黑心病和抗氧化代谢的影响[R].北京:中国农业大学热带果树研究院,2006.[6]李美茹.低温下水稻幼苗叶片细胞膜膜脂过氧化和膜磷脂脱酯化反应[C