实验二细菌的革兰氏染色及芽孢染色法

实验一存在问题1、香柏油要加适量2、涂完菌后接种环一定要灼烧灭菌3、无菌操作4、擦镜纸浪费5、载玻片要洗干净6、画图不符合要求本文档共24页；当前第1页；编辑于星期日\13点4分细菌个体微小半透明

未染色细菌大致形态大小单染色法复染色法能看清形态大小但是无鉴别意义能看清形态大小又有鉴别意义显微镜细菌的染色本文档共24页；当前第2页；编辑于星期日\13点4分（一）实验目的：1、学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。

2、巩固显微镜油镜的使用技术和无菌操作技术。本文档共24页；当前第3页；编辑于星期日\13点4分革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。（二）实验原理——革兰氏染色原理本文档共24页；当前第4页；编辑于星期日\13点4分革兰阳性菌细胞壁的化学组成肽聚糖（15-50层）细胞膜（双层脂质

蛋白嵌镶）脂质蛋白质β-1,4糖苷键N-乙酰葡萄糖胺N-乙酰胞壁酸四肽链五肽桥本文档共24页；当前第5页；编辑于星期日\13点4分革兰阴性菌细胞壁的化学组成外膜肽聚糖（1-3层）细胞膜脂质蛋白质脂质双层脂蛋白脂多糖本文档共24页；当前第6页；编辑于星期日\13点4分G+菌细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，网格结构紧密，含脂量低，当被酒精脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以至关闭，从而阻止了不溶性结晶紫-碘复合物的逸出，还是原来的颜色。

G¯肽聚糖层较薄，交联度低，含较多类脂质，故用乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞被脱色，经沙黄复染呈红色。结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色番红复染涂片固定（二）实验原理——革兰氏染色原理本文档共24页；当前第7页；编辑于星期日\13点4分芽孢（内生孢子）及其研究芽孢的重要性芽孢是某些G+菌形成的圆形或椭圆形的休眠体，抗热性和折光性较强。芽孢的大小、形态、位置可做分类依据。

（二）实验原理——芽孢染色法原理本文档共24页；当前第8页；编辑于星期日\13点4分中央芽孢偏端芽孢游离芽孢末端芽孢本文档共24页；当前第9页；编辑于星期日\13点4分（二）实验原理——芽孢染色法原理芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难；但当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，染料可进入菌体和芽孢；进入菌体的染料经水洗后可被脱色；当用对比度大、浅色的复染色剂（番红）染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色（绿色），而菌体呈复染剂颜色（红色）。本文档共24页；当前第10页；编辑于星期日\13点4分1、活材料：革兰氏染色：培养12h-16h枯草杆菌（Bacillussubtilis）和培养24h大肠杆菌（Escherichiacoli）芽孢染色：培养28-36小时的蜡状芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）2、染色液和试剂：革兰氏染色染色液：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红；芽孢染色液：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液；二甲苯、香柏油。3、器材：载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。（三）实验器材本文档共24页；当前第11页；编辑于星期日\13点4分1.细菌涂片标本的制作（1）涂片载玻片1张，加1滴生理盐水，取菌研磨均匀。（2）干燥室温干燥，或置酒精灯高处慢慢烘烤。（3）固定干燥后的涂片，在酒精灯火焰中通过3次。（四）实验步骤——革兰氏染色本文档共24页；当前第12页；编辑于星期日\13点4分本文档共24页；当前第13页；编辑于星期日\13点4分2.革兰法染色（1）初染结晶紫2min细水冲洗甩去积水（2）媒染卢戈碘液1min细水冲洗甩去积水（3）脱色95%乙醇20-30s细水冲洗甩去积水（4）复染番红3min细水冲洗甩去积水（四）实验步骤——革兰氏染色本文档共24页；当前第14页；编辑于星期日\13点4分3.观察实验结果待标本自干或用吸水纸吸干后，置显微镜下检查。革兰阳性菌（G+），被染成蓝紫色。革兰阴性菌（G-），被染成红色。（四）实验步骤——革兰氏染色本文档共24页；当前第15页；编辑于星期日\13点4分实验程序Ⅰ（革兰氏染色的方法和步骤）涂片蒸馏水涂片结晶紫

碘液95%乙醇自然干燥媒染1min脱色20~30s初染1min、后水洗固定

番红复染2min干燥

镜检水洗时不要直接冲菌膜水洗水洗水洗每人取大肠杆菌和枯草杆菌，做一块混合涂片，进行革兰氏染色。2分钟1分钟3分钟干燥固定本文档共24页；当前第16页；编辑于星期日\13点4分取一干净载玻片→→在两端各加一滴生理盐水→→无菌操作取菌种→→涂于生理盐水中（成菌膜）→→自然干燥→→火焰固定→→初染（结晶紫，2min）

→→水洗→→媒染（碘液，1min）

→→水洗→→脱色（乙醇，20-30s）

→→水洗→→复染（蕃红，3min）

→→水洗→→自然干燥→→观察。（四）实验步骤——革兰氏染色本文档共24页；当前第17页；编辑于星期日\13点4分涂片时，滴生理盐水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄；酒精脱色：是革兰氏染色成败的关键，要求脱至流出的乙醇不带颜色为止，立即水洗。若脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后（冲反面），应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。革兰氏染色注意事项本文档共24页；当前第18页；编辑于星期日\13点4分制备菌悬液染色涂片固定脱色复染镜检改良的Schaeffer-Fulton氏染色法（四）实验步骤——芽孢染色本文档共24页；当前第19页；编辑于星期日\13点4分芽孢染色---制备菌悬液生理盐水

1、滴生理盐水

挑取2-3环菌苔与生理盐水混匀2、制备菌悬液在EP管中滴2滴生理盐水本文档共24页；当前第20页；编辑于星期日\13点4分芽孢染色---染色5%孔雀绿染液1、滴加孔雀绿染液沸水浴加热15-20min2、加热染色在离心管中滴2-3滴孔雀绿染液本文档共24页；当前第21页；编辑于星期日\13点4分芽孢染色---涂片固定经孔雀绿染色细菌悬液1、滴菌悬液用接种环均匀涂布2、涂片接种环取菌悬液在载玻片中央

3、干燥室温自然晾干4、固定通过酒精灯火焰3次固定本文档共24页；当前第22页；编辑于星期日\13点4分芽孢染色---复染0.5%番红水溶液1、滴番红水溶液滴加数滴番红染液在菌膜上，染色2min2、水洗不要直接冲菌膜本文档共24页；当前第23页；编辑于星期日\13点4分蜡状芽孢杆菌（B.cer）1、制备菌液：加2滴蒸馏水于1.5ml离心管中，用接种环从斜面挑取菌体2-3环于离心管中充分混匀。（2人一组）2、染色：加孔雀绿2-3滴于小试管中。3、加热：沸水浴，15-20分钟