基因组学第章基因组结构的维持

第三章基因组结构的维持与改变本文档共71页；当前第1页；编辑于星期六\2点31分

基因组结构维持与改变基因组的相对稳定(维持)是物种生存的需要：依靠复制（模板依赖性）与修复基因组改变是进化的基础基因组改变的类型：1)突变(mutation)小范围序列改变单个或几个核苷酸的替换、插入、缺失来源于DNA复制错误或诱变破环。2)重组(recombination)大范围序列重建同源重组、位点特异性重组、转座来源于染色体内或染色体间序列的交换。本文档共71页；当前第2页；编辑于星期六\2点31分

基因组改变与修复本文档共71页；当前第3页；编辑于星期六\2点31分主要内容基因组复制突变与DNA修复重组与转座本文档共71页；当前第4页；编辑于星期六\2点31分第一节基因组复制本文档共71页；当前第5页；编辑于星期六\2点31分半保留复制与拓扑结构问题1953年，Watson&Crick提出DNA双螺旋结构同年，提出复制的可能方式：两条母链均可作为模板来合成新DNA链半保留复制DNA双螺旋结构的难题—拓扑结构问题：复制时两条链如何打开？

本文档共71页；当前第6页；编辑于星期六\2点31分DNA复制的三种可能途径本文档共71页；当前第7页；编辑于星期六\2点31分半保留复制的实验证明—Meselson-Stahl实验（1）在含有15NH4Cl的培养基中培养大肠杆菌将细菌转移到正常培养基（含14NH4Cl）分别于细菌分裂一次和两次后取样，密度梯度离心本文档共71页；当前第8页；编辑于星期六\2点31分半保留复制的实验证明—Meselson-Stahl实验（2）细胞中必然存在着一种解决拓扑学问题的方法本文档共71页；当前第9页；编辑于星期六\2点31分拓扑异构酶—解旋酶解决了拓扑问题催化断裂-再连接反应的酶。在DNA分子一条或两条链上形成切口，通过切口解开螺旋。本文档共71页；当前第10页；编辑于星期六\2点31分在复制过程中拓扑异构酶解旋DNA双螺旋本文档共71页；当前第11页；编辑于星期六\2点31分以半保留模式为主体的不同复制形式替代复制滚环复制本文档共71页；当前第12页；编辑于星期六\2点31分复制过程DNA的复制发生在细胞周期的S期起始延伸终止本文档共71页；当前第13页；编辑于星期六\2点31分复制起始—双向复制基因组中形成两个复制叉（复制眼），分别以一条链为模板，双向复制每条链复制中，DNA合成方向相同：5’到3’两条链复制行进的方向相反本文档共71页；当前第14页；编辑于星期六\2点31分基因组结构与复制起点复制起始存在着固定的位点，复制起点(originofreplication)细菌：环形基因组只有单一的复制起点真核生物：线性基因组存在多个复制起点酵母：332个人类：20000个本文档共71页；当前第15页；编辑于星期六\2点31分大肠杆菌复制起点复制起点oriC，长约245bp2个重复基序1）9核苷酸5拷贝DnaA蛋白结合位点结合30个DnaA蛋白2）13核苷酸3拷贝富含AT几个解旋相关蛋白

DnaA,HU,DnaCDnaB解旋酶本文档共71页；当前第16页；编辑于星期六\2点31分酵母复制起点自主复制序列ARS，不足200bp含四个具相似序列的亚结构域：A+B1起始识别序列约40bp，为起始识别复合物（ORC)结合部位B3与大肠杆菌复制起点相似结合ARS结合因子（ABF1)，从而使B2的双螺旋结构解开本文档共71页；当前第17页；编辑于星期六\2点31分高等生物复制起点目前仍难以确认将某些复制起始区域转入复制缺陷性质粒后不能重建复制能力存在酵母ORC蛋白同源基因本文档共71页；当前第18页；编辑于星期六\2点31分复制延伸在复制起点形成复制叉母代双链中一条连续复制，称前导链；一条不连续，称滞后链（半不连续）DNA聚合酶引物本文档共71页；当前第19页；编辑于星期六\2点31分参与DNA复制的DNA聚合酶细菌5个，其中DNA聚合酶III是复制酶真核生物9个，其中DNA聚合酶δ是复制酶本文档共71页；当前第20页；编辑于星期六\2点31分前导链连续合成，后滞链非连续合成合成方向：5’到3’滞后链合成中，最初形成一些短的片段，称冈崎片段细菌冈崎片段长约1000-2000个核苷酸，真核生物的冈崎片段则短得多，少于200个核苷酸模板依赖性的DNA聚合酶需要引物来启动单链上的DNA合成

本文档共71页；当前第21页；编辑于星期六\2点31分非连续合成中的引物与引发酶RNA引物：DNA聚合酶不能作用于无引物的单链模板，而RNA聚合酶可以细菌中引发酶（primase）合成4-15bp的引物引发酶不是转录酶本文档共71页；当前第22页；编辑于星期六\2点31分细菌和真核生物在DNA合成引发中的差异

细菌只需引发酶合成RNA引物真核生物由引发酶和DNA聚合酶α形成复合物合成RNA引物和其后的约20个DNA核苷酸本文档共71页；当前第23页；编辑于星期六\2点31分大肠杆菌复制需要多种蛋白的协作拓扑异构酶、解旋酶(DnaB)：解旋DNA聚合酶III：复制引发酶；提供引物单链结合蛋白（SSB)：稳定打开的双链

连接酶：连接冈崎片段其它蛋白

本文档共71页；当前第24页；编辑于星期六\2点31分大肠杆菌复制中解旋酶的作用DnaB是大肠杆菌中复制相关的主要解旋酶，是一种5’->3’解旋酶它可以沿后滞链移动，同时使碱基对断裂另外两种3’->5’解旋酶：PriA、Rep拓扑异构酶解除解旋所产生的扭转张力本文档共71页；当前第25页；编辑于星期六\2点31分大肠杆菌复制中单链结合蛋白的作用单链结合蛋白（SSB），复制中打开的单链容易重新结合及降解，SSB是一种缺乏酶活性的蛋白，会结合到多聚核苷酸上防止两条链的重新结合及降解。大肠杆菌SSB是由4个相同的亚基组成。当复制复合物开始复制时，SSB必须与单链分离，这一作用由复制介导蛋白（replicationmediatorprotein,RMP）来完成。本文档共71页；当前第26页；编辑于星期六\2点31分引发小体（primosome）与复制体（replisome）引发小体,复制起始中，解旋酶结合到起点以后形成引发前复合物，然后引发酶结合，形成引发小体。引物合成后，由DNA聚合酶III二聚体来延伸。DNA聚合酶III二聚体与引物小体结合称为复制体。本文档共71页；当前第27页；编辑于星期六\2点31分大肠杆菌复制中完成滞后链合成的方式复制酶DNA聚合酶III不具备5’->3’外切酶活性，到达下一个冈崎片段末端的RNA引物时停止DNA聚合酶I和RNaseH共同作用去除RNA引物，代之以DNA

本文档共71页；当前第28页；编辑于星期六\2点31分真核生物中后滞链合成的方式RNaseH模型：RNaseH去除引物至其最后一个核苷酸，侧翼内切核酸酶(FEN1)去除最后一个核苷酸和部分DNA侧翼模型：DNA聚合酶δ和解旋酶使引物与模板间碱基对断开，并被推成分支，再有FEN1切除分支本文档共71页；当前第29页；编辑于星期六\2点31分大肠杆菌基因组复制终止不允许发生的情况本文档共71页；当前第30页；编辑于星期六\2点31分存在终止序列：Tus蛋白识别位点Tus蛋白的不同结合方向控制了复制叉是否能够通过本文档共71页；当前第31页；编辑于星期六\2点31分真核生物线性DNA分子末端的维持：所复制的DNA分子可能变短的问题本文档共71页；当前第32页；编辑于星期六\2点31分线性DNA分子的末端变短的原因本文档共71页；当前第33页；编辑于星期六\2点31分真核生物DNA末端(端粒)由端粒酶合成人类染色体末端的延伸由端粒酶完成染色体末端延伸过程的完成本文档共71页；当前第34页；编辑于星期六\2点31分端粒长度和衰老癌症有关本文档共71页；当前第35页；编辑于星期六\2点31分Cell：庄小威揭示端粒功能新机制本文档共71页；当前第36页；编辑于星期六\2点31分第二节突变与DNA修复本文档共71页；当前第37页；编辑于星期六\2点31分复制中的突变复制中的自发错误尽管DNA聚合酶存在校正能力，但是但突变仍不可避免大肠杆菌的复制错误率1/107，经修复后基因组复制总错误率降至1/1011-10

点突变转换嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶颠换嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤插入或缺失出现在编码区可能导致移码其它区域可能导致多态性（复制滑移）本文档共71页；当前第38页；编辑于星期六\2点31分物理和化学诱变导致突变化学：1）碱基类似物替代标准碱基参与复制5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤2）脱氨3）烷化4）嵌入溴化乙锭物理：1）紫外辐射形成嘧啶二聚体2）电离辐射3）加热本文档共71页；当前第39页；编辑于星期六\2点31分突变可能不影响基因组存在很多不影响基因组功能的突变沉默突变：1）突变在基因间非调控区域或基因间非编码区域，对整体基因组功能无影响的突变。可发生在人类基因组的98.5%。2）编码区的突变不影响编码蛋白的氨基酸序列，同义突变

本文档共71页；当前第40页；编辑于星期六\2点31分点突变对基因编码区的四种影响同义：突变后，由于密码子兼并性，而不影响所编码的氨基酸非同义：引起氨基酸的错误编码无义：引起过早终止通读：引起无法终止本文档共71页；当前第41页；编辑于星期六\2点31分编码区的插入或缺失突变可能导致不同的影响插入或缺失的核苷酸是3的倍数，仅影响个别氨基酸，因此影响可能较小非3的倍数，将导致移码本文档共71页；当前第42页；编辑于星期六\2点31分非编码区突变可能影响基因组的功能基因表达调控区域的突变：顺式作用元件，如核心启动子、关键调节序列内含子剪接位点的突变：如5’剪接点本文档共71页；当前第43页；编辑于星期六\2点31分DNA聚合酶确保DNA复制精确性的机制核苷酸选择聚合前选择正确的核苷酸校对3’到5’外切酶活性，聚合后切除错配的核苷酸本文档共71页；当前第44页；编辑于星期六\2点31分四类DNA修复系统直接修复切除修复针对诱变损伤错配修复针对复制错误重组修复本文档共71页；当前第45页；编辑于星期六\2点31分人类DNA修复基因本文档共71页；当前第46页；编辑于星期六\2点31分切除修复主要修复系统，人类参与蛋白最多的修复系统碱基切除单核苷酸切除15个基因参与核苷酸切除一段核苷酸切除28个基因参与本文档共71页；当前第47页；编辑于星期六\2点31分碱基切除修复DNA糖基化酶切除碱基，产生无碱基（AP）位点AP内切核酸酶产生单核苷酸切口DNA聚合酶填补碱基DNA连接酶连接断裂本文档共71页；当前第48页；编辑于星期六\2点31分核苷酸切除与UvrAB修复系统本文档共71页；当前第49页；编辑于星期六\2点31分错配修复中子代DNA的识别针对复制错误，所以发生与子代DNA分子一个问题：如何区分子代DNA分子?大肠杆菌中子代新生分子尚未甲基化，从而可以区分甲基化位点：5’-GATC-3’A甲基化5’-CCA/TGG-3’C甲基化本文档共71页；当前第50页；编辑于星期六\2点31分错配修复与Mut修复系统本文档共71页；当前第51页；编辑于星期六\2点31分双链断裂修复比单链损伤严重可能由电离辐射和化学诱变产生也可能由重组产生也称为重组修复本文档共71页；当前第52页；编辑于星期六\2点31分SOS应答回避是生存的一种方式修复难以进行时绕过主要损伤位点，允许某些复制错误保留，继续复制本文档共71页；当前第53页；编辑于星期六\2点31分第三节重组与转座本文档共71页；当前第54页；编辑于星期六\2点31分重组与进化重组，各种包括多聚核苷酸断裂和再连接的过程。没有遗传重组就没有进化重组使不利和有利的突变得以分离，使适者生存，因此是自然选择的遗传学基础。重组的一般类型----同源重组（一般性重组）位点特异性重组（同源区很短）转座本文档共71页；当前第55页；编辑于星期六\2点31分同源重组（Homologousrecombination）同源重组，也叫一般性重组（generalrecombination）,发生在具有高度序列同源性的DNA片段之间。这些片段可处在不同染色体上，也可以是同一染色体的不同部分。真核生物中，发生于减数分裂时期，负责减数分裂中的互换。本文档共71页；当前第56页；编辑于星期六\2点31分同源重组的Holliday模型交换连接分支迁移断裂Holliday结构分离本文档共71页；当前第57页；编辑于星期六\2点31分重组是由于异源双链体DNA间发生断裂与重连两条双链DNA分子间的重组关键是单链的交换交换产生异源双链体DNA片段当双链体DNA的单链与相对应的另一双链体中的单链发生置换时，会产生一个分叉结构（Holliday结构）分叉迁移使交叉点移动，封闭切口两次（相互的）交换才能产生一个联合分子联合分子可以通过切开相接的链来形成两条分开的双链体分子本文档共71页；当前第58页；编辑于星期六\2点31分Holliday结构与重组体的形成重组体是否形成取决于参与交换的链在解离过程中是否被切开切开，则水平分离，基因组不是重组体，但包含异源双链体DNA不切开，则垂直分离，产生互相重组的基因组本文档共71页；当前第59页；编辑于星期六\2点31分Holliday模型的缺陷与Meselson-Radding修正模式Holliday模型的缺陷：切口是如何出现在两条分子的同一位置的？单分子切口切口链侵入未打开的双螺旋，形成D-环被取代链断开，形成另一个分子上的切口修正：在两分子切口形成过程中引入交换的D环本文档共71页；当前第60页；编辑于星期六\2点31分大肠杆菌重组系统：1）RecBCD形成单链切口

RecBCD具有核酸内切酶活性和解旋酶活性内切酶：于Chi位点切开单链chi位点5’-GCTGGTGG-3’解旋酶：使单链末端游离本文档共71页；当前第61页；编辑于星期六\2点31分大肠杆菌重组系统2)RecA链交换DNA聚合酶填补间隙RuvA,B分叉迁移RuvC切除Holliday连接点本文档共71页；当前第62页；编辑于星期六\2点31分Holliday模型修正后无法解释基因转换配子（AA)X配子（aa)合子（AAaa)单倍体孢子（A或a)正常情况：A/a=1/1基因转换：A/a不=1/1本文档共71页；当前第63页；编辑于星期六\2点31分双链断裂模型单分子双链断裂外切酶使断裂扩大一个3’端侵入未打开的双螺旋，形成D-环另一个3’端链延伸相互移动形成双交换，即形成两个Holliday结构本文档共71页；当前第64页；编辑于星期六\2点31分两个Holliday结构的解离可以解释基因转换本文档共71页；当前第65页；编辑于星期六\2点31分位点特异性重组（site-specificrecombination）同源重组是发生于两段高度序列同源的DNA区域间，但是这种广泛同源的区域并不是重组的必要条件，该过程也能由两个只具有很短相同序列的DNA分子引发。这称为位点特异性的重组。λDNA整合到大肠杆菌基因组中本文档共71页；当前第66页；编辑于星期六\2点31分λDNA整合到大肠杆菌基因组中参与的酶整合通过att位点，λ基因组中的attP位点和大肠杆菌基因组中的attB位点，之间的特异性重组进行。每个结合位点的中心