第十三单元综合性实验演示文稿

第十三单元综合性实验演示文稿本文档共35页；当前第1页；编辑于星期二\20点47分优选第十三单元综合性实验本文档共35页；当前第2页；编辑于星期二\20点47分实验原理

检测伤寒O抗体在伤寒菌感染的诊断中具有重要意义，采用肥达反应可对抗体进行半定量检测；若采用新一代的免疫检测技术建立对伤寒O抗体准确定量检测的法，则可提高临床诊断效果。以伤寒O抗原免疫动物，制备出抗伤寒O的抗体，将后者纯化抗体与酶连接制备成酶标抗体;以伤寒O抗原包被酶标板，制备伤寒酶标抗体为竞争抗体，以竞争法检测伤寒抗体酶联免疫检技术。本文档共35页；当前第3页；编辑于星期二\20点47分1.伤寒沙门菌菌体“O”抗原（免疫用）2.伤寒沙门菌可溶性菌体“O”抗原（包备用）3.饱和硫酸铵溶液4.酶标用洗涤液5.酶标用稀释液6.酶标用底物液7.酶标用终止液(2mol/LH2SO4)8.伤寒“O”抗原包被酶标板9.待检血清标本10.实验室标准阳性血清11.ELISA读数仪实验材料

本文档共35页；当前第4页；编辑于星期二\20点47分制备抗伤寒O抗体和O抗原抗体纯化酶(HRP)标记抗体竞争ELISA检测伤寒O抗体条件的优化标准曲线确定标本检测与结果判断实验流程

本文档共35页；当前第5页；编辑于星期二\20点47分取伤寒沙门菌标准菌株（伤寒沙门菌O901）的典型光滑型菌落，密集划线接种于普通琼脂平板，37℃培养24h，用无菌生理盐水洗下菌苔，移入无菌的三角烧瓶中。充分振摇，置100℃水浴1h，杀菌及破坏H抗原。菌悬液离心，4000r/min，10min，弃上清。菌体再用无菌生理盐水洗涤，弃上清。无活菌试验合格后，用无菌生理盐水稀释成8~10亿／ml，即成伤寒沙门菌“O”菌体抗原。实验方法

伤寒沙门菌菌体“O”抗原（免疫用）

本文档共35页；当前第6页；编辑于星期二\20点47分取伤寒沙门菌O901接种于普通琼脂平板，37℃培养24h，用无菌生理盐水洗下菌苔，配成70~100亿/ml菌悬液，隔水煮沸2h，离心，3500r/min，10min，取上清即伤寒沙门菌可溶性菌体“O”抗原。伤寒沙门菌可溶性菌体“O”抗原（包备用）日期第1天第2天第3天第4天第5天抗原剂量（ml）0.10.20.30.51.0途径多点皮内耳缘静脉耳缘静脉耳缘静脉耳缘静脉表1制备细菌免疫血清的免疫程序本文档共35页；当前第7页；编辑于星期二\20点47分抗体制备

制备抗伤寒O抗体推荐快速免疫方案供参考采用（表1）：取已制备的伤寒沙门氏菌体O抗原（１０亿／ml），免疫程序如下表。最后两次注射剂量较大，要缓慢推注。在末次免疫2天后试血，采用直接凝集法测定效价（见第二单元）。如凝集效价大于1∶1280，则可于一周后放血。效价过低，可再加强注射。日期第1天第2天第3天第4天第5天抗原剂量（ml）0.10.20.30.51.0途径多点皮内耳缘静脉耳缘静脉耳缘静脉耳缘静脉表1制备细菌免疫血清的免疫程序本文档共35页；当前第8页；编辑于星期二\20点47分

1份免疫血清加1份生理盐水，边搅拌边滴加2份饱和硫酸铵溶液，于4℃静置2h，2000r/min离心20min，吸弃上清，将沉淀溶于适量生理盐水（尽量保持高蛋白浓度），放置透析袋中，多次更换生理盐水(透析液)，得初步纯化的免疫抗体。采用改良NaIO4标记法将酶与抗体的连接，其他备选的标记方法请参考单元一。抗体的纯化与酶标记

本文档共35页；当前第9页；编辑于星期二\20点47分取5mgHRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06MNaIO4水溶液0.5ml，混匀，4℃30min；再加入0.16M乙二醇水溶液（10mlH2O+0.09ml乙二醇）0.5ml，室温放置30min。然后加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，于0.05MpH9.5碳酸盐缓冲液中搅拌透析6h（或过夜），使之结合；加入NaBH4溶液（5mg/ml）0.2ml，混匀，4℃2h；最后缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min，离心，去上清，以0.02MpH7.4PBS液溶解沉淀并4℃透析除盐过夜；次日取出离心，去除沉淀，即得酶-抗体（HRP-IgG）结合物，以0.02MpH7.4PBS液加至5ml。改良NaIO4标记法将酶本文档共35页；当前第10页；编辑于星期二\20点47分①将酶标抗体用稀释液做系列稀释，加入包被有伤寒抗原的酶标板中（50μl/孔），37℃30min。②洗涤液充分洗涤3次，甩干。③各孔内加底物液0.1ml，置暗处20min。④各孔内加入终止液终止反应。⑤用酶标仪检测OD值。以OD值在0.８左右的最小稀释倍数为待检样本的最佳稀释倍数。抗竞争法酶标抗体工作浓度的确定本文档共35页；当前第11页；编辑于星期二\20点47分①从5倍开始用酶标稀释液进行系列倍比稀释（连续稀释10个管），与确定工作浓度的酶标抗体一同加入包被有伤寒抗原的酶标板中，另在2孔中加入稀释液作空白对照，置37℃恒温箱30min。②取出用洗涤液充分洗涤3次，甩干。③各孔内加底物液0.1ml，置暗处20min。④各孔内加入终止液终止反应。⑤用酶标仪检测OD值。空白对照OD值在0.8左右实验成立，以标本OD值在0.8～0.05的稀释度（抗体单位）作为标准品的工作范围，根据对标准抗体血清所测得的OD值，在方格纸上以OD值为x轴，抗体单位为Y轴绘制标准曲线。标准曲线的制备

本文档共35页；当前第12页；编辑于星期二\20点47分按预试验摸索的实验条件进行测定：①将标准血清进行系列倍比稀释（连续稀释10个管）。②将待检血清用酶标稀释液适当稀释。③稀释液作空白对照。④将稀释的酶标抗体（50μl/孔），同待检标本、不同单位的标准血清和空白对照标本一同加入包被有伤寒抗原的酶标板中（50μl/孔）。⑤置37℃恒温箱30min。⑥加底物，终止反应后检测OD值。标本检测本文档共35页；当前第13页；编辑于星期二\20点47分

阳性标本反应孔不显色，空白标本反应孔显色说明实验成立。根据对标准抗体血清所测得的OD值和其所对应的抗体单位标绘制准曲线或建立的回归方程，根据绘制的准曲线求出每个标本的抗体单位。结果判定

本文档共35页；当前第14页；编辑于星期二\20点47分

1.请就方法学评价肥达反应和竞争ELISA法检测伤寒“O抗体”。例如，方法的稳定性、特异性和敏感性。

2.人类与伤寒沙门菌接触密切，通常情况下伤寒抗体均阳性。个体伤寒O抗体水平与伤寒感染和机体免疫状态有关，因此建立群体伤寒O抗体水平的正常范围对判定个体伤寒的感染和机体免疫状态具有重要价值。如何建立新方法检测伤寒O抗体的参考范围（正常值）?实验讨论

吉林医药学院李妍本文档共35页；当前第15页；编辑于星期二\20点47分实验二机体免疫功能评估

（综合性实验）本文档共35页；当前第16页；编辑于星期二\20点47分无胸腺的裸鼠是T细胞选择性缺陷的天然动物模型本文档共35页；当前第17页；编辑于星期二\20点47分人的重症联合型免疫缺陷综合征本文档共35页；当前第18页；编辑于星期二\20点47分实验原理

利用淋巴细胞敏感的细胞毒药物抑制或杀伤淋巴细胞，使机体免疫功能低下。给实验动物（小鼠）注射抗原，通过观察小鼠机体免疫抗体的反应水平评价机体的体液免疫水平。二硝基氟苯（DNFB）是一种半抗原，将其溶液涂抹腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4～7天后将其再次涂抹，可使局部产生迟发型超敏反应（水肿），通过观察迟发型超敏反应程度对小鼠机体的细胞免疫功能做出评价。.鸡卵卵核蛋白抗原是天然的可溶性抗原，注入机体可诱导特异抗体产生，当免疫细胞受到抑制，B细胞活化和抗体产生能力下降，检测特异性抗体产生可评价体液免疫功能。本文档共35页；当前第19页；编辑于星期二\20点47分实验材料

1.免疫抑制剂环磷酰胺，氢化可的松。2.免疫抗原1%的二硝基氟苯（DNEB），鸡卵卵核蛋白。3.酶标用洗涤液，稀释液，底物液，酶标用终止液（2mol/LH2SO4）。4.抗原包被的酶标板用包被液将免疫用抗原稀释20倍加到酶标板中，每孔0.1ml，置湿盒中4℃过夜；次日取出，用蒸馏水充分洗涤3次，甩干备用。5.酶标仪6.酶标抗小鼠IgG抗体。7.抗体标准品多支小鼠抗鸡卵卵核蛋白抗体的混合物。8.1ml注射器，采血用手术器械，分离血清用器材，天平，绘图纸等。本文档共35页；当前第20页；编辑于星期二\20点47分基础免疫实验分组对照组抗原激发造模组迟发型超敏反应（二硝基氟苯）特异性抗体的诱发（鸡卵卵核蛋白）抗体效价测定皮肤超敏反应观察空白组实验流程

非免疫动物本文档共35页；当前第21页；编辑于星期二\20点47分1.二硝基氟苯致敏:将小鼠腹部去毛，范围约3×3cm2大小，并将１％DNFB溶液均匀涂抹于上。2.可溶抗原致敏:取小鼠于大腿内侧注射卵核抗原0.2ml/只。抗原。

实验方法

基础免疫

本文档共35页；当前第22页；编辑于星期二\20点47分将做过基础免疫的小鼠随机分成两组（造模组和实验对照组）；另取数量相等的未经免疫的小鼠为空白对照组。造模组小鼠可采用以下方法之一诱导免疫抑制,也2方法均用,进行对比。方法一:每鼠腹腔注射环磷酰胺50mg/kg（参考剂量），连续5天后免疫功能显著降低。方法二：每鼠每天腹腔注射氢化可的松50mg/kg（参考剂量），5天后免疫功能显著受抑。实验动物分组与免疫模型建立

本文档共35页；当前第23页；编辑于星期二\20点47分致敏后第7天，将１％DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击，空白对照组同样涂耳但未致敏。攻击后24h，剪下左右耳壳，取同样大小的耳片，称重。迟发型超敏反应激发(细胞免疫功能检测)

特异性抗体的诱发(体液免疫功能检测)

基础免疫后第7天再次注射抗原，方法同基础免疫。5-7天后采血测抗体。在优化间接法检测小鼠抗卵核抗原的条件的基础上;采ELISA检测实验组和空白组小鼠特异抗体的浓度。本文档共35页；当前第24页；编辑于星期二\20点47分优化间接法检测小鼠抗卵核抗原的条件①将待检血清从5倍开始用酶标稀释液进行系列倍比稀释（连续稀释10个管），分别加入已用抗原包被好的酶标板中（每孔加0.1ml），置37℃恒温箱30min。②取出用洗涤液充分洗涤3次，甩干。③各孔加酶标抗体0.1ml，置37℃恒温箱30min。④取出用洗涤液充分洗涤3次，甩干。⑤各孔内加底物液0.1ml，置暗处20min。⑥各孔内加入终止液终止反应。⑦用酶标仪检测OD值。以OD值在0.30左右的最小稀释倍数为待检样本最佳稀释倍数。本文档共35页；当前第25页；编辑于星期二\20点47分①将待检血清按预实验确定的稀释倍数用酶标稀释液进行稀释，分别加入已用抗原包被好的酶标板中（每孔加0.1ml）。②将标准血清进行系列倍比稀释（连续稀释10个管），分别加入已用抗原包被好的酶标板中（每孔加0.1ml）。③另在2孔中加入稀释液作空白对照。④置37℃恒温箱30min。⑤洗涤，加酶标抗体，加底物，终止反应和检测OD值。优化间接法检测小鼠抗卵核抗体本文档共35页；当前第26页；编辑于星期二\20点47分1.细胞免疫功能的判定以剪下的左右耳片重量之差为迟发型超敏反应程度，可以反映机体细胞免疫水平。模型组免疫功能下降，迟发型超敏反应强度下降。结果判断

本文档共35页；当前第27页；编辑于星期二\20点47分2.体液免疫根据对标准抗体血清所测得的OD值（标准血清及待检血清OD值在计算时均应减去空白对照OD值），在方格纸上以OD值为x轴，抗体单位为Y轴绘制标准曲线；或采用数学模型进行线性转化，建立回归方程。根据标绘制的准曲线或建立的回归方程，可以求出每个标本的抗体单位。模型组免疫功能下降，特异抗体产生下降。本文档共35页；当前第28页；编辑于星期二\20点47分实验讨论

1.举例说明人体在哪些情况下发生免疫缺陷。

2.针对本实验建立的模型，你还能想到哪些方法或指标来评价免疫功能？本文档共35页；当前第29页；编辑于星期二\20点47分实验三免疫相关疾病的实验诊断

（科研设计）本文档共35页；当前第30页；编辑于星期二\20点47分免疫学检验的与临床疾病对自身免疫性疾病的诊断对免疫增生性疾病的诊断对感染性疾病的诊断对机体免疫状态进行综合评价肿瘤标志物对肿瘤进行早期诊断或病情监测本文档共35页；当前第31页；编辑于星期二\20点47分主要课程讨论安排

第一阶段:重点是与临床医师和患者本人接触，或通过查阅有关书籍和互联网增加对疾病和疾病的诊断过程的感性认识;第二阶段:有针对性地、系统地收集有关临床实验诊断数据和资料，作为分析和讨论的基础；第三阶段:对实验数据和资料进行总结分析并提出有关设想或新的实验诊断方案；第四阶段:回到临床与临床医师或指导教师共同探讨有关诊断的做出方案的合理性并形成文字材料，召开有专家参加的讨论会或报告会。本文档共35页；当前第32页；编辑于星期二\20点47分免疫学诊断的核