海洋小单孢菌来源的轻快菌素B-FW523

海洋小单孢菌来源的轻快菌素BFW5233的体外抗肿瘤活性【摘要】目的考察轻快菌素BFW5233的体外抗肿瘤活性。方法采用MTT比色分析法、流式细胞法和高内涵药物筛选的方法检测FW5233对肿瘤细胞株细胞生长、细胞周期、肿瘤细胞骨架蛋白、线粒体膜电位的影响。结果FW5233对肿瘤细胞株K562、L929的生长有明显抑制作用，IC50分别为500和400ng/ml。FW5233处理后的K562肿瘤细胞阻滞在G0/G1期。FW5233使L929肿瘤细胞的细胞核大小、细胞骨架纤维状肌动蛋白FActin量、线粒体膜电位明显减少。结论FW5233有显着抗肿瘤活性。

【关键词】轻快菌素；抗肿瘤作用；海洋小单胞菌

ABSTRACTObjectiveToinvestigatetheantitumoractivitiesofrakicidinBFW5233invitro.MethodsTheinhibitoryeffectsoftheFW5233totheproliferation,cycle,skeleton,mitochondrialmembranepotentialofthetumorcellswereassayedbythecolorimetricMTTassay,flowcytometryandhighcontentscreeningmethods.ResultsFW5233stronglyinhibitedthecellproliferationofK562andL929tumorcelllineswithIC50valueof500ng/mland400ng/ml,respectively.K562cellswerearrestedinG0/G1phasewhentreatedwithFW5233,whichhadtheabilitytodecreasethesizeofnucleolus,disrupttumorcellFactinsynthesisandreducemitochondrialmembranepotential.ConclusionFW5233exhibitedpotentantitumoractivities.

KEYWORDSRakicidin;Antitumor;MarineMicromonospora

微生物次级代谢产物是新药的重要来源。海洋微生物具有独特的代谢方式，产生的次级代谢物化学结构具有明显的复杂性和多样性，有的是陆地微生物所不具备的。海洋微生物药物的研究开发始于20世纪70年代，在90年代得到很大的。迄今已从海洋微生物的代谢产物中分离出几百种生物活性物质，其中有些是可能有价值的抗肿瘤抗生素，如海洋放线菌产生的新型抗肿瘤抗生素lomaiviticins［1］和salinosporamideA［2］已进入临床研究阶段。因此从海洋微生物中筛选到新型抗肿瘤抗生素的成功率相对较大。

从海洋小单孢菌筛选新抗肿瘤生物活性物质过程中，我们发现了海洋小单孢菌Micromonosporasp.FIM02523产生有抗肿瘤活性的脂肽类化合物FW523，该化合物有5个单组分。经波谱分析和理化性质研究，发现组分3(FW5233)与轻快菌素B(rakicidinB)同质［3］。本文报道FW5233的体外抗肿瘤活性。

1材料与方法

样品FW5233样品(HPLC纯度%)，福建省微生物研究所国家新药微生物筛选实验室制备；紫衫醇(paclitaxol)购自美国Sigma公司。上述样品分别用无水乙醇配制成1mg/ml母液，-20℃备用。

方法

(1)FW5233对人类红白血病肿瘤细胞株K562细胞生长的抑制作用肿瘤细胞株K562细胞以2×105/ml浓度加入96孔板，每孔100μl，分别加入用完全1640培养液稀释的FW5233，空白对照只加培养液，将培养板置37℃、5%CO2培养箱培养72h，把培养后的96孔板以MTT比色分析法测定各孔在570nm的光吸收值A570，计算不同浓度的FW5233对细胞增长的抑制率。

抑制率=(对照A570值-样品A570值)对照A570值×100%

(2)对人类红白血病肿瘤细胞株K562细胞周期的影响对数增长期的K562细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔细胞1×106个，总体积4ml，加入FW5233至其终浓度分别为125、250、500和2000ng/ml，36h时终止培养。分别收集细胞，PBS洗两次(1000r/min，5min)，细胞重悬于1ml冷75%乙醇中固定过夜，加等量的PBS洗两次(1000r/min，5min)，加胰RNA酶(10mg/ml，Sigma产品)100μl，置37℃15min。加碘化丙啶(PI)溶液(PI50μg/ml，柠檬酸钠%，TritonX100%)500μl，4℃30min，用流式细胞仪(BeckmanCoulterEpicsXLCytometer)检测并分析结果。

(3)对小鼠成纤维细胞L929细胞凋亡的影响L929细胞以3000个/孔的密度接种到胶原蛋白包被的96孔板上，37℃，5%CO2培养箱培养24h，加入不同浓度的FW5233，继续培养24h，对照药物为紫衫醇。应用美国Cellomics公司多指标细胞凋亡试剂盒进行测定，按试剂盒操作程序分别加入线粒体、细胞核荧光染色剂和细胞骨架纤维状肌动蛋白Factin的荧光染色剂，使用该公司的高内涵药物筛选系统(ArrayScanHCS)采集数据并进行分析［4］。

2结果

对肿瘤细胞凋亡及细胞周期的影响

FW5233对人类红白血病K562肿瘤细胞生长有很强的抑制作用(IC50约500ng/ml)。K562肿瘤细胞培养液加入FW5233至终浓度125、250、500和2000ng/ml，培养36h时用流式细胞仪分析细胞凋亡和细胞周期。药物处理组可见明显的凋亡峰，随药物浓度增大，凋亡细胞的比例增加。药物处理后的K562肿瘤细胞阻滞在G0/G1期，S期细胞比率下降()。G0/G1期的阻滞使细胞进入S期减少，抑制肿瘤细胞的增殖。

对肿瘤细胞核、骨架蛋白、线粒体膜电位的影响

应用Cellomics公司多指标细胞凋亡试剂盒测定，并以紫衫醇为对照药物，应用该公司的ArrayScanHCS系统采集数据。FW5233对L929肿瘤细胞生长有明显的抑制作用，IC50为400ng/ml(紫衫醇IC50500ng/ml)，表明FW5233(rakicidinB)对肿瘤细胞生长的抑制作用浓度与对照药物紫杉醇相当。超过1μg/ml的FW5233使L929肿瘤细胞的细胞核大小、细胞骨架纤维状肌动蛋白FActin量、线粒体膜电位均明显减少，然而紫衫醇100ng/ml以上使L929肿瘤细胞细胞核明显增大，FActin含量增加，线粒体膜电位明显增加(～)。以上结果说明FW5233与紫衫醇抗肿瘤细胞的作用机制不同，FW5233能抑制肿瘤细胞微丝的合成，降低肿瘤细胞线粒体膜电位。

3讨论

本研究表明轻快菌素BFW5233能明显抑制肿瘤细胞的生长，抑制肿瘤细胞微丝合成。高内涵筛选实验发现FW5233与轻快菌素rakicidinA、B一样具有抗肿瘤活性，其抗肿瘤活性与紫杉醇相当，FW5233和紫衫醇对L929肿瘤细胞生长的IC50分别为400和500ng/ml。FW5233能抑制肿瘤细胞L929的生长，使L929细胞核缩小、细胞骨架纤维状肌动蛋白Factin含量、线粒体数量及膜电位均减少。FW5233抑制肿瘤细胞L929生长的作用机制与紫衫醇不同，特别是它能抑制肿瘤细胞微丝的合成并降低线粒体膜电位。

抗肿瘤药物的筛选靶位很多，作用于细胞骨架微丝是其中一个靶位。微丝在多种肿瘤细胞中被大量修饰，并伴随着微丝相关调节蛋白的改变，与肿瘤细胞异常的生长特点如黏附及转移有关［5，6］。以微丝及其相关调节蛋白为靶点的抗肿瘤药物对肿瘤细胞有较高的选择性，目前作用于微丝的药物仅发现了不到10种，如来源于真菌的细胞松弛素(cytochalasin)阻止肌动蛋白聚合成微丝，具有抗肿瘤的潜能。生物碱鬼笔环肽(phalloidin)同细胞松弛素的作用相反，只与聚合的微丝结合，而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后，抑制了微丝的解体，因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡，也具有抗肿瘤作用［7～9］。Lantrunculins是一类来自海洋生物的抗肿瘤药物，可与多种肿瘤细胞的微丝结合，并使之解聚，抑制肿瘤细胞增殖［10］。2005年又报道了来源于海绵的bistheonellideA和phenochalasinB是新的破坏微丝的药物［11］。这些作用于微丝的药物都是国外发现的，国内未进行这方面的药物筛选。我们实验首次报道海洋小单胞菌产生的轻快菌素BFW5233是一类具有抑制肿瘤细胞微丝合成的新化合物。

FW5233作用于肿瘤细胞的另一个靶点可能是线粒体，因为它能使肿瘤细胞线粒体膜电位下降。肿瘤细胞在凋亡早期，即在出现细胞核凋亡征象(染色质凝聚和DNA片段化)前出现线粒体跨膜电位降低。一旦出现线粒体膜电位下降，即进入不可逆的凋亡过程［12，13］。来自海洋软体动物的生物活性物质lamellarinD抗肿瘤细胞的靶点之一就是使线粒体跨膜电位下降［14］。FW5233是如何作用于肿瘤细胞微丝合成及降低线粒体膜电位而导肿瘤细胞凋亡的机制有待进一步研究。

【参考文献】

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