质粒DNA的酶切鉴定

质粒DNA的酶切鉴定实验目的1、学习限制性内切酶的特性2、掌握酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法高中教材分析限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。1)寄主控制的限制与修饰现象2)核酸限制性内切酶的类型和特征4)同裂酶和同尾酶5)核酸限制性内切酶的命名法6)影响核酸限制性内切酶活性的因素寄主控制的限制与修饰现象restrictionmodificationsystem细菌可以合成一种或多种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不起作用。2)限制性核酸内切酶的类型及特性第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近1000bp的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边20-30核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。

IIIIII作用底物双链DNA双链DNA双链DNA识别序列特异特异特异切割位点距识别部在识别部位内部距识别部位位1000bp25－27bp功能切割、修饰切割切割、修饰能量需要不需要需要举例EcoBEcoKEcoRIEcoPI①粘性末端限制性内切酶进行酶切时，两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置如果是交错的，产生的DNA片段末端的一条链多出一到多个核苷酸，这样的末端称为粘性末端。SmaICCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置如果是平齐的，这样的末端称为平末端。②平末端2II型限制性内切酶的命名原则(1)限制性内切酶的基本名由3个字母组成。第一个是该酶所属微生物属名的第一个字母，大写斜体。第二个和第三个字母是该酶所属微生物种名的第一和第二个字母，小写斜体。例如：大肠杆菌EscherichiacoliEco

流感嗜血菌HaemophilusinfluenzaeHin

14（2）如同一种菌有不同的菌株或不同的品系，把菌株或品系的名称写在基本名的后面。

如从大肠杆菌R品系中分离到的酶，记做EcoR（3）同一种菌有几种不同的酶时，用罗马数字表示。如在大肠杆菌中R品系中分离到了5种酶，分别叫EcoRI、EcoRII……EcoRV（4）如同一属中不同种的种名前两个字母相同时，取种名较靠前的字母表示HaemophilusparainfluenzaeHarHaemophilusparahaemlyticusHph15FlavobacteriumokeanokoitesAcetobacterpasteurianusB16识别位点的序列相同的限制性内切酶。同裂酶（Isoschizomers)HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’

HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’

17识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等。同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’

BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。185’-GATC----3’3’----CTAG-5’Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。？5’-G3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’

BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’

BamHIBglⅡSau3A195)影响内切酶切割效率的因素(1)DNA的纯度；(2)DNA的甲基化程度；(3)酶切消化反应的温度；(4)DNA的分子结构；(5)溶液中离子浓度及种类；(6)缓冲液的pH值。InsertEcoR1Xho1质粒【酶切的实验步骤】在一个洁净的1.5mL离心管中混匀下列反应物：反应物体积（µL）ddWater810×Buffer2质粒DNA8EcoRI2总计202、将反应物置于37℃水浴，温浴1.5小时。3、加入5µL加样缓冲液，混匀后即可加样进行电泳。4、在紫外观察分析仪上观察酶切的结果。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素：DNA分子的大小、DNA的构象、电压和电场方向等。溴化乙锭（EthidiumBromide，EB）。它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng的DNA。2KbDNALadder不能对DNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。2)琼脂糖凝胶的制备0.8g琼脂糖100mL

TAE溶液→沸水溶解→60℃±（不烫手）加入GoldView→轻轻摇晃均匀→制胶→凝固→电泳3）加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约5～10