番鸭呼肠孤病毒病防控技术规程

番鸭呼肠孤病毒病防控技术规程1范围本标准规定了番鸭呼肠孤病毒病的诊断、预防和控制措施。本标准适用于番鸭呼肠孤病毒病的预防和控制。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB13078饲料卫生标准GB/T36195畜禽粪便无害化处理技术规范NY/T1167畜禽场环境质量及卫生控制规范NY5027无公害产品畜禽饮用水水质NT/T5030无公害农产品兽药使用准则《病死及病害动物无害化处理技术规范》农医发（2017）25号3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。番鸭呼肠孤病毒病（Muscovyduckreovirusdisease，MDRVD）是由番鸭呼肠孤病毒（MDRV）引起的以番鸭软脚、肝脾灰白色坏死点为特征的急性、接触性传染病，又称“番鸭肝白点病”或“花肝病”，该病属于免疫抑制性疫病。4诊断4.1流行病学本病在自然条件下只感染雏番鸭，发病日龄在4～50日龄之间，其中以7～35日龄的感染最为常见，日龄越小发病的危害程度越严重，病程长短不一，通常为14～21天。本病一年四季均可发生，但在冬春季节较少见，天气炎热、潮湿，鸭群应激时发病率升高，病原可通过消化道和呼吸道感染进行水平传播，也可通过种鸭进行垂直传播。4.2临床症状发病番鸭精神不振，羽毛蓬乱无XX，食欲减少或废绝，畏冷扎堆，不愿走动，腹泻，排绿色或黄白色稀粪，有大量稀粪粘附在肛门周围，泄殖腔扩张、外翻，大部分番鸭表现为软脚，病鸭死亡快，经过3-5天，发病率和死亡率逐渐增加，病程稍长的患病番鸭会出现趾关节或跗关节肿大、跛行，耐过病番鸭生长发育迟缓，成为僵鸭。4.3病理变化对病死番鸭的病变主要集中在肝脏和脾脏，肝脏肿大、质脆，表面有出血点或出血斑，表面和实质密布大量肉眼可见的坏死点，呈灰白色或灰黄色，甚至连成花斑样病灶。脾脏肿大呈暗红或黑紫色，质地变硬，表面和切面实质有大小不等白色或黄白色坏死点或坏死灶；肾脏肿大、出血；随着病程的XX部分病例可见严重的心包积液、心包炎和肝周炎。4.4实验室检测4.4.1逆转录聚合酶链式扩增反应（RT-PCR）检测RT-PCR检测方法见附录A。阳性对照出现300bp的扩增条带，阴性对照无条带时检测结果成立，当被检样品扩增出与阳性对照大小一致的特异性条带时为阳性，否则为阴性。4.4.2间接免疫荧光（IFA）检测IFA检测方法见附录B。在200倍或400倍荧光显微镜下观察，空白样品无荧光时检测结果成立，当被检组织样品出现明显的亮绿色荧光时为阳性，否则为阴性。4.5结果判定4.5.1符合4.1、4.2和4.3的，判定为疑似感染。4.5.2符合4.1、4.2和4.3，且符合4.4.1或4.4.2时，判定被检番鸭样品存在MDRV感染。5疫情处理当疫情发生时，应按照《中华人民共和国动物防疫法》的规定进行处理。6预防与控制6.1预防6.1.1引种管理异地引入种番鸭和种蛋时，应取得原产地动物防疫监督机构的检疫合格证明。到达引入地后，种番鸭和种蛋孵化的雏番鸭必须隔离饲养15天以上，并有引入地动物防疫监督机构进行检测，确认健康无疫后，方可进行混群饲养。6.1.2孵化管理由于MDRV可以垂直传播，因此发生过该病的番鸭群不能留作种用。6.1.2.2带毒的种蛋和孵化出的雏鸭可能成为孵化场的重要感染源，加强孵化管理尤为重要。收集好的种蛋在入孵前，采用福尔马林熏蒸消毒，或使用其他高效低毒消毒药剂进行消毒，消毒药剂按照使用说明书正确使用。6.1.2.3孵化室底面和墙壁可用2%烧碱水喷洒消毒，孵化室和孵化箱的空间采用尔马林熏蒸消毒。出雏箱采用一次性纸箱或经过严格消毒的塑料箱，批次出雏结束后，对使用过的出雏箱或其他器具先采用2%的烧碱水或2%的漂白粉浸泡2～3小时后取出，清水冲洗，晾干备用。6.1.2.4出雏结束后，及时清除出雏间和疫苗接种间的灰尘和绒毛，采用2%的烧碱水进行喷洒消毒。6.1.3饲养管理6.1.3.1饲料应符合GB13078的要求，饮水水质应符合NY5027的要求。6.1.3.1加强雏鸭的养殖管理，做好育雏舍的保温工作，尽可能减少和降低噪音、惊吓和疫苗接种等因素造成的鸭群应激，番鸭舍的环境应符合NY/T1167的要求。6.1.3.3番鸭场应采取分批次生产，不同日龄的番鸭群不能混样。控制人员、车辆和物资出入，严格执行场区清洁的消毒程序，番鸭场卫生管理标准应符合NY/T1167的要求。按照GB/T36195的规定进行对番鸭的粪便和垫料等污染物进行及时处理。6.1.4免疫接种雏番鸭在1日龄使用番鸭呼肠孤病毒病活疫苗（CA株）进行免疫，每羽番鸭腿部肌肉注射1羽份，番鸭出壳后免疫1次即可；或使用经国务院兽医主管部门批准上市的其他番鸭呼肠孤病毒病疫苗，并按使用说明书要求进行免疫。6.2控制6.2.1疫情上报发生该病时应当向当地兽医主管部门或动物疫病预防控制机构进行报告，并在相关部门的指导下处理疫情。6.2.2消毒管理及时隔离发病番鸭群，对鸭舍、环境和用具等进行严格消毒，参照NY/T1167中的规定执行。6.2.3治疗措施该病目前无特效治疗药物，对发生该病的番鸭群，采用番鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体注射液进行紧急治疗和预防，用法和用量按照使用说明书执行。在饲料或饮水中添加黄芪多糖等抗病毒中药制剂提高番鸭群的抗病毒能力；存在继发细菌感染时应通过药敏试验选择高敏抗生素进行治疗，药物的使用应符合NY/T5030的规定；同时在饮水中加入多种维生素和葡萄糖等进行辅助治疗。6.2.4无害化处理对病死番鸭和废弃物的处理应符合农医法[2017]25号的规定；对粪便及其他可能被污染的物品按照GB/T36195中的规定进行无害化处理。

附录A（规范性附录）番鸭呼肠孤病毒RT-PCR检测A.1阳性对照的制备A.1.1引物P1:5’-GCATGAACATGCCAGTTGAG-3’；P2:5’-AAGCCATAACGATGGCAGTC-3’，扩增产物长度为300bp。A.1.2番鸭呼肠孤病毒RNA的提取和cDNA合成收集接种MDRV的SPF鸭胚尿囊液，按照市售RNA提取试剂盒操作说明书提取RNA，按照市售商品化cDNA合成试剂盒说明书反转录合成cDNA，-20℃保存备用。A.1.3PCR反应体系和反应程序PCR反应体系（25uL）：10×PCRbuffer（含MgCl2）2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，引物P1、P2各1μL（25pmol/μL），合成cDNA2μL，ddH2O11μL。PCR反应程序：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃保存。A.1.4PCR产物电泳和回收用微量移液器向25μLPCR产物加入5PCR产物6×上样缓冲液，充分混合后，加入1%X脂糖凝胶的样品孔中，以DL2000DNAMarker为指示，在TAE电泳缓冲液中，电压90V，时间40min后，在凝胶成像系统中观察结果。根据DL2000DNAMarker确定MDRV扩增的特异性条带，用手术刀切下该条带的凝胶块，按照市售商品化的凝胶回收试剂盒进行PCR产物的回收。A.1.4PCR产物克隆A.1.4.1采用商品化的T4克隆载体和DH5ɑ感受态细胞将PCR产物连接入载体并转化到DH5ɑ感受态细胞中，具体操作参照T4克隆载体和DH5ɑ感受态细胞的使用说明书。A.1.4.2利将转化后的DH5ɑ接种到含有X-gal和IPTG的LB固体培养基进行阳性克隆的筛选，携带有T4克隆载体的菌落为白色。A.1.4.2挑选白色菌落在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培养6-8小时，采用市售商品化的细菌质粒DNA提取试剂盒提取细菌质粒DNA，采用A.1.3中的PCR反应体系（以质粒DNA替代cDNA）和程序进行阳性克隆的鉴定。A.1.5质粒的提取将鉴定为阳性的克隆菌株，接种到含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培养6-8小时，采用市售商品化的细菌质粒DNA提取试剂盒提取细菌质粒DNA，所提取的质粒作为番鸭呼肠孤病毒RT-PCR检测的阳性对照。A.2番鸭临床组织样品的检测A.2.1组织样品RNA的提取和cDNA合成采集临床发病番鸭的肝脏或脾脏组织，加入等量的生理盐水进行研磨，5000转/分钟，离心5min，取上清作为检测样品，参照A.1.2中的步骤进行检测样品RNA的提取和cDNA的合成。A.2.2PCR反应体系和反应程序样品检测的PCR反应体系和反应程序参照A.1.3，并以制作的阳性质粒为扩增模板设置阳性对照，以ddH2O为扩增模板设置阴性对照。A.2.2结果判定PCR产物经1%的X脂糖凝胶电泳，XX性对照出现300bp的条带，阴性对照无条带时，检测结果成立。当被检样品出现与阳性对照大小一致的特异性条带时，判定为MDRV核酸检测阳性，否则判定为阴性。

附录B（规范性附录）番鸭呼肠孤病毒IFA检测B.1切片制备采集发病番鸭肝、脾和肾等组织器官保存在-20℃，通过冷冻切片机进行组织样品的冰冻切片，将冷冻的切片立即与室温的载玻贴合片上，用预冷的丙酮固定切片10min，清水冲洗后立即进行检测或在-20℃冻存备用。B.2IFA检测步骤取上述制备好的切片加1:100稀释的MDRV的单克隆抗体，并以生理盐水代