实时荧光定量技术全面分析演示文稿

实时荧光定量PCR技术全面分析演示文稿当前第1页\共有61页\编于星期四\22点目录实时定量PCR基本原理实时定量PCR的实验设计和数据处理实时定量PCR两种相对定量方法比较实时定量PCR实验实例分析实时定量PCR常见故障排查实时定量PCR的新应用当前第2页\共有61页\编于星期四\22点实时定量PCR基本原理当前第3页\共有61页\编于星期四\22点常规vs实时常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析当前第4页\共有61页\编于星期四\22点常规vs实时优缺点比较

定量PCR

常规PCR灵敏度高高精确度安全省时只能进行半定量或定性分析不安全易污染费时费力当前第5页\共有61页\编于星期四\22点定量PCR三个基本概念扩增曲线指数增长期

平台期线性增长期背景期当前第6页\共有61页\编于星期四\22点阈值与C(t)值阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长期C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04当前第7页\共有61页\编于星期四\22点定量PCR的数学原理理想的PCR反应：Xn=X0×2n非理想的PCR反应：Xn=X0(1+Ex)n方程式两边同时取对数得: logXn=log(X0(1+Ex)n)

整理方程式得:

logX0=(-log(1+Ex))×n+logXn将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上式得：

logX0=(-log(1+Ex))×C(t)+logXc(t)

初始浓度的对数与循环数呈线性关系n：扩增反应的循环次数Xn：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率当前第8页\共有61页\编于星期四\22点荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线10410310610510210C(t)与初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系当前第9页\共有61页\编于星期四\22点定量原理浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（Ct值）就可分析样品中起始模板量当前第10页\共有61页\编于星期四\22点化学原理化学方法分类非特异性SYBRGreenI法特异性TaqMan探针法当前第11页\共有61页\编于星期四\22点SYBRGreenI法结合双链DNA分子小沟延伸结束，形成双链DNA，SYBRGreen结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度优点使用方便，无需复杂的设计成本较低缺点与非特异性产物结合，无模板特异性试验方法较难优化灵敏度低当前第12页\共有61页\编于星期四\22点TaqMan探针法水解型报告基团，淬灭基团FRET（荧光谐振能量传递）识别特异性产物优点特异性高，可准确定量灵敏度高设计不同标记的探针，可进行多重检测缺点一个探针只适用于一个目标价格较高探针设计较繁琐当前第13页\共有61页\编于星期四\22点两种化学的比较化学试剂工作原理有否淬灭剂信号检测阶段SYBRGreenI结合于双链DNA的小沟中否延伸TaqMan水解型杂交探针（5‘-3’外切）有任何步骤当前第14页\共有61页\编于星期四\22点定量PCR的实验设计和数据处理绝对定量与相对定量当前第15页\共有61页\编于星期四\22点绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）相对定量：计算初始反应模板的相对含量当前第16页\共有61页\编于星期四\22点定量PCR--绝对定量标准品，标准曲线已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线样品与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值unknown104103当前第17页\共有61页\编于星期四\22点使用定量PCR进行绝对定量的优势敏感性高检测低拷贝数样品：单拷贝大范围拷贝数样品同时检测100—1010省时有效当前第18页\共有61页\编于星期四\22点定量PCR--相对定量相对定量的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）相对定量的问题样品材料不均一造成的差别内标基因内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响）对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的误差当前第19页\共有61页\编于星期四\22点SYBRGreenI法进行相对定量的问题问题：SYBRGreenI可以与非特异性双链结合非特异产物信号结果不准确解决办法：引入熔链曲线分析当前第20页\共有61页\编于星期四\22点熔链曲线分析在PCR反应程序结束后，逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线温度荧光信号强度TmTm值：DNA解链一半时的温度-dIdTTm当前第21页\共有61页\编于星期四\22点熔链曲线分析决定退火温度Non-specificproductspecificproductspecificproduct当前第22页\共有61页\编于星期四\22点实时定量PCR两种相对定量方法比较相对双标准曲线法和2-ΔΔc(t)

法当前第23页\共有61页\编于星期四\22点相对标准曲线法用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值用内标基因对目标基因均一化处理样本与未处理样本目标基因C(t)值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异当前第24页\共有61页\编于星期四\22点适用范围目标基因与内标基因扩增效率差异较大扩增效率较低当前第25页\共有61页\编于星期四\22点2-ΔΔc(t)

法公式推导M:目标基因，N：内标基因XC(t)M=X0M*2C(t)M=A(域值)(1)XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域值)(2)均一化(1)/(2):X0M/X0N=2C(t)N-C(t)M=2-ΔC(t)处理2与处理1相比：

(X0M2/X0N2):(X0M/X0N)=2-ΔC(t)2-ΔC(t)1=2-ΔΔC(t)ΔΔC(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1)当有多个样品时（如时间点），各样品均一化后都与同一时间点相比当前第26页\共有61页\编于星期四\22点一般步骤选定目标基因和内标基因设计一步法或两步法RT-PCR反应数据获得及处理目标基因C(t)值（处理，未处理）内标基因C(t)值（处理，未处理）计算2-ΔΔc(t)

作图当前第27页\共有61页\编于星期四\22点适用范围当扩增效率较高，且目标基因和内标基因扩增效率比较一致★不做标准曲线，高通量检测当前第28页\共有61页\编于星期四\22点目标基因和内标基因扩增效率的快速检测通过并列跑两条扩增曲线，查看指数增长期的曲线之间是否平行当前第29页\共有61页\编于星期四\22点验证试验目的基因和内参基因扩增效率一致性检测检测目标基因与内标基因在不同稀释浓度下的ΔC(t)，以稀释倍数与ΔC(t)作图，当直线的斜率近似于0（绝对值要小于0.1）时，说明目标基因与内标基因扩增效率一致。当前第30页\共有61页\编于星期四\22点问题与解决为保证扩增效率一致扩增子长度引物设计模板纯度、复杂度等反应条件当前第31页\共有61页\编于星期四\22点定量PCR实验实例分析

当前第32页\共有61页\编于星期四\22点利用TaqMan法研究ERBB2在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异（相对标准曲线法）已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准选用GAPDH作为内标基因FAM标记的ERBB2探针VIC标记的GAPDH探针构建标准曲线双重PCR反应阴性对照无RNA对照（空白）无逆转录酶对照（基因组）当前第33页\共有61页\编于星期四\22点标准曲线Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2当前第34页\共有61页\编于星期四\22点样品扩增：正常vs肿瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH肿瘤肿瘤正常正常当前第35页\共有61页\编于星期四\22点实验结果MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma28.4027.3628.4627.1228.43±0.0426.24±0.17ERBB2表达MultiplexReactions:C(t)HealthyRNACarcinoma23.2722.8123.4122.8628.34±0.1026.83±0.03GAPDH表达当前第36页\共有61页\编于星期四\22点实验结果HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/µlTotalRNAERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.0110.0180.018/0.011＝1.6300.20.40.60.811.21.41.61.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpression当前第37页\共有61页\编于星期四\22点（2-ΔΔc(t)

法）ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.182-ΔΔc(t)结果与双标准曲线法相近HealthyRNABBER2GAPDHΔC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43±0.0428.34±0.105.18±0.18CarcinomaRNABBER2GAPDHΔC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2626.24±0.1726.83±0.034.41±0.21当前第38页\共有61页\编于星期四\22点实时定量PCR常见故障排查当前第39页\共有61页\编于星期四\22点故障排查---软件界面扩增曲线标准曲线原始数据当前第40页\共有61页\编于星期四\22点扩增曲线当前第41页\共有61页\编于星期四\22点异常扩增曲线当前第42页\共有61页\编于星期四\22点扩增曲线基线设置是否正确

基线校准

基线开始值(3-10)

基线终止值（指数期之前）阈值设置是否正确

设置在指数增长期(可自动或手动设置）当前第43页\共有61页\编于星期四\22点当前第44页\共有61页\编于星期四\22点当前第45页\共有61页\编于星期四\22点标准曲线当前第46页\共有61页\编于星期四\22点原始数据当前第47页\共有61页\编于星期四\22点常见问题抑制物PCR前精密度差扩增曲线异常PCR后标准曲线差当前第48页\共有61页\编于星期四\22点抑制物PCR抑制物

多糖类、有机溶剂、蛋白酶K等样本质量A260/A280----DNA:≥1.8----RNA:≥2.1RT反应中的抑制物----RNA标准曲线

当前第49页\共有61页\编于星期四\22点PCR抑制物抑制物？当前第50页\共有61页\编于星期四\22点样本质量起始模板量越高，抑制物含量越高当前第51页\共有61页\编于星期四\22点RNA标准曲线当前第52页\共有61页\编于星期四\22点精密度差精密度高精密度低40次相同的重复3次相同的重复