宫颈鳞状细胞癌组织Smad4表达及临床意义

宫颈鳞状细胞癌组织Smad4表达及临床意义【摘要】目的探讨宫颈鳞状细胞癌组织Smad4表达与临床病理特征的关系。方法采用免疫组织化学SP法检测28例正常宫颈上皮(NCE)、36例宫颈上皮内瘤变(CIN)和68例SCC组织中Smad4的表达情况,检测Ki-67增殖指数(PI)和CD34微血管密度(MVD)。结果Smad4在NCE，CIN及SCC组的阳性表达率分别为%,%和%。从NCE到CIN及SCC,Smad4阳性表达率显着降低()。在SCC组,随Smad4表达降低,盆腔淋巴结转移率显着升高(χ2=,P=);随Smad4表达增强,PI和MVD均有升高趋势,均未达统计学意义()。SCC组Smad4表达与年龄、FIGO分期、组织学分级、浸润深度、脉管浸润与否及预后无显着相关性()。结论Smad4蛋白表达降低可能参与SCC的发生和转移过程。

【关键词】宫颈肿瘤;基因,肿瘤抑制;转化生长因子β;肿瘤转移;预后;免疫组织化学

ABSTRACT:ObjectiveToinvestigateexpressionofSmad4andtheircorrelationwithclinic-pathologiccharacteristicsincervicalsquamouscellcarcinoma.MethodsTheexpressionofSmad4,proliferationindex(PI)ofcancercellslabeledbyKi-67andmicrovesseldensity(MVD)labeledbyCD34in28casesofnormalcervicalepithelium(NCE),36casesofcervicalintraepithelialneoplasm(CIN)and68casesofsquamouscarcinomaofcervix(SCC)weredetectedbyimmunohistochemistrySPmethod.ResultsThepositiveratesofexpressionofSmad4inNCE,CINandSCCgroupwere%,%and%,respectively.ThepositiveexpressionofSmad4decreasedremarkablyfromasequenceofNCEtoCINandSCC().TherateofpelviclymphnodemetastasisinSCCwassignificantlyincreasedfollowingSmad4lowerexpression(χ2=,P=).ThePIandMVDinSCCwereincreasedfollowingSmad4higherexpression,butitwasnotsignificant().TheexpressionofSmad4inSCCwasnotcorrelatedwithpatientsage,FIGOstaging,histologicalgrading,stromainvolvement,intravascularinfiltrationorprognosis().ConclusionThelossexpressionofSmad4proteinmayparticipateinpathogenesisandmetastasisincervicalsquamouscellcarcinoma.

KEYWORDS:cervicalneoplasm;genes,tumorsuppressor;transforminggrowthfactorbeta;neoplasmmetastasis;prognosis;immunohistochemistry

转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)控制细胞的生长、分化、凋亡、胚胎发育,激活细胞膜上的Ⅰ型受体(TGF-βRⅠ),再激活Smad家族蛋白而调节相关基因的表达,在细胞信号转导中起重要作用［1］。在Smad家族中,DPC4(deletedinpancreaticcancer,locus4)/Smad4与肿瘤的关系尤为密切［1］。有报道宫颈癌中Smad4表达缺失［2-3］。笔者采用免疫组织化学(SP法)检测Smad4在宫颈鳞状细胞癌组织的表达情况,探讨其表达与局部肿瘤血管生成、癌细胞增殖、侵袭转移及预后的关系。

1对象与方法

对象

临床资料见文献［4］。

试剂

鼠抗人Smad4单克隆抗体(产品编号BA1397,武汉博士德生物工程有限公司),鼠抗人Ki-67单克隆抗体(克隆号MIB1)、鼠抗人CD34单克隆抗体(克隆号QBEnd/10)、超敏免疫组织化学染色试剂盒和DAB染色剂(福州迈新生物技术有限公司)。

方法

所有新鲜标本均经4％甲醛溶液固定,48h内取材,石蜡包埋,连续3~5μm切片。采用免疫组织化学SP法检测CIN和SCC组织中Smad4的表达情况。步骤按说明书操作。Smad4采用EDTA(pH)水煮高温修复抗原DAB显色,苏木精对比染色。用已知阳性片作为阳性对照,用PBS代替第一抗体作为阴性对照。

结果判断

Smad4主要表达于细胞质,部分表达于细胞核。Smad4表达根据文献［5］的标准判定:弥漫阳性():细胞质中染色深且比较一致,细胞核中有灶状染色;局灶阳性(+):部分区域细胞质和/或细胞核阳性;阴性(－):细胞质及细胞核均无棕黄色颗粒。在光镜下随机观察10个高倍视野(×400),每个视野记数100个肿瘤细胞,计算总阳性标记细胞数。Ki-67标记的增殖指数(PI):CD34标记的微血管密度见文献［4］。

统计学处理

采用SPSS统计软件包分析,半定量资料比较采用χ2检验或精确概率法检验,定量资料比较采用t检验,变量间的关系采用相关分析,生存情况采用Kaplan-Meier曲线表示,Logrank检验。检验水准α=,以为差别有统计学意义。

2结果

Smad4在NCE，CIN及SCC组的表达

从NCE→CIN→SCC,Smad4表达显着降低(,表1)。Smad4在CINⅠ，Ⅱ，Ⅲ的阳性表达率分别为%(5/12),%(6/11)及%(4/13),各组之间比较差别无统计学意义()。Smad4在NCE，CIN及SCC组的表达见图1。表1NCE、CIN及SCC组Smad4的表达

Smad4在NCE，CIN及SCC组的表达与PI的关系

在NCE中,Ki-67标记的PI随Smad4表达增强而显着升高()。相关分析显示,Smad4在NCE中表达与PI显着正相关(r=,P=)。Smad4在CIN和SCC中表达与PI均无显着相关性(前者r=,P=;后者r=,P=,表2)。表2NCE，CIN及SCC组Smad4表达与PI及MVD的关系

Smad4在NCE，CIN及SCC组的表达与MVD的关系

Smad4在NCE，CIN及SCC组中表达与CD34标记的MVD均无显着相关性(NCE:r=－,P=;CIN:r=-,P=;SCC:r=,P=,表2)。

Smad4在SCC组的表达与临床病理特征的关系

Smad4在SCC组的表达与盆腔淋巴结转移密切相关(χ2=,P=),而与年龄、FIGO分期、组织学分级、间质浸润深度及脉管浸润无关(,表3)。表3宫颈鳞状细胞癌组Smad4的表达与临床病理特征的关系

Smad4在SCC组的表达与预后的关系

将Smad4在SCC组的表达分为阴性和阳性组,两组Kaplan-Meier生存曲线见图2。两组患者的生存率比较差别无显着性,Logrank检验,P=。

3讨论

有报道,Smad4表达降低或缺失参与宫颈上皮癌变［2-3］。本研究显示,Smad4在NCE、CIN及SCC中的阳性表达率分别为%,%及%。Smad4在NCE组表达与CIN及SCC组比较,差别有统计学意义(),Smad4蛋白在CIN和SCC组表达显着降低,与文献报道一致。1996年,Hahn等发现并克隆出抑癌基因DPC4/Smad4［6］。DPC4/Smad4基因位于人染色体,cDNA全长1656bp,编码552个氨基酸序列,编码产物为64kD蛋白质Smad4。TGF-β从细胞质到细胞核的信号转导需要Smads蛋白介导。TGF-β与其受体结合后,在细胞质内与受体调节型Smad结合,后者与Smad4形成三聚体,进入细胞核与特异的DNA结合,抑制细胞周期关联蛋白CDK4-CyclinD以及下游CDK2-CyclinE复合体活性,阻碍细胞从G1向S期转化,抑制细胞增殖［7］。Smad4是TGF-β信号转导的细胞内信使,其在TGF-β诱导基因表达调控和随后的生长抑制中是必不可少的关键转录因子［8］。TGF-β信号传导途径中的任一因子失活均可导致信号传导途径中断,而在该通路中最常改变的是DPC4/Smad4［9］。Smad4突变使其与途径限制性Smads不能形成复合物,不能进入细胞核,从而使TGF-β信号转导中断,细胞逃脱TGF-β的生长抑制作用而失控,诱发癌症。笔者认为,在CIN和SCC组Smad4表达降低可使TGF-β信号转导减弱或中断而不能介导TGF-β的生长抑制效应,使细胞生长失控而诱发CIN及癌变。

刘景波等报道,前列腺增生组织Smad4蛋白及mRNA表达显着增高,并与PI显着正相关,Smad4可能促进细胞增殖而参与前列腺增生,Smad4虽为一种肿瘤抑制基因,但可能具有促进增殖作用［10］。本研究显示,Smad4在NCE中表达与PI显着正相关,随Smad4表达增强,PI显着增加,提示Smad4表达增强也可能促进宫颈上皮细胞增殖瘤变。Smad4基因突变与癌症进展和淋巴结转移密切相关,往往提示预后不良［11］。吴慧丽等报道,Smad4低表达与结肠癌浸润深度、淋巴结转移及MVD密切相关,提示Smad4低表达可增加肿瘤血管生成［12］。笔者研究显示,在SCC中,随Smad4表达降低,盆腔淋巴结转移显着升高,随Smad4表达增强,PI和MVD均有升高趋势,但均无统计学意义()。笔者认为,SCC组织Smad4表达降低可能使癌细胞逃脱TGF-β的生长抑制作用而促进增殖,同时也可能增加肿瘤血管生成为癌细胞提供营养而加速转移。本研究结果还显示,Smad4在SCC组表达与年龄、FIGO分期、组织学分级、间质浸润深度及脉管浸润均无显着相关性()。

胃癌Smad4阳性表达者肿瘤细胞分化好,生长速度慢,侵袭和转移能力弱,预后较好［13］。在本研究中,将Smad4在SCC组表达分为阴性和阳性组,描绘两组患者Kaplan-Meier生存曲线,阴性组生存率与阳性组比较无统计学意义。Smad4表达与SCC预后关系的研究刚刚开始,可能有不同结果,有待深入研究。

【参考文献】

［1］MoustakasA,SouchelnytskyiS,HeldinCH.SmadregulationinTGF-βsignaltransduction［J］.JCellScience,2001,114(Pt24):4359-4369.

［2］BaldusSE,SchwarzE,LohreyC,etal.Smad4deficiencyincervicalcarcinomacells［J］.Oncogene,2005,24(5):810-819.

［3］MaliekalTT,AntonyML,NairA,etal.Lossofexpression,andmutationofSmad2andSmad4inhumancervicalcancer［J］.Oncogene,2003,22(31):4889-4897.

［4］林岷，江忠清，连成瑛，等.宫颈鳞状细胞癌局部淋巴管生成与浸润转移及预后的关系［J］.福建医科大学学报，2008,42：116-120.

［5］WilentzRE,SuGH,DaiJL,etal.Immunohistochemicallabelingfordpc4mirrorsgeneticstatusinpancreaticadenocarcinomas:anewmarkerofDPC4inactivation［J］.AmJPathol,2000,156(1):37-43.

［6］HahnSA,SchutteM,HoqueAT,etal.DPC4,acandidatetumorsuppressorgeneathumanchromosome［J］.Science,1996,271(5247):350-353.

［7］KjellmanC,OlofssonSP,HanssonO,etal.ExpressionofTGF-betaisoforms,TGF-betareceptors,andSmadmoleculesatdifferentstagesofhumanglioma［J］.IntJCancer,2000,89(3):251-258.

［8］PascheB.Roleoftransforminggrowthfactorbetain