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第十九章制药过程分析概论目录12第二节光谱学分析方法3第三节过程色谱系统4第四节流动注射分析法5第五节聚焦光束反射测量技术6学习要求第一节概述1.掌握全面质量控制、过程分析、过程分析方法等的概念及特点;2.熟悉制药过程分析的一般方法;3.了解各类方法在药物过程分析中的应用。学习要求质量源于检验(qualitybytesting,QbT)质量源于生产(qualitybyproduction,QbP)质量源于设计(qualitybydesign,QbD)QbD是制药工业的方向。药品的质量不是检验出来的,而是生产出来的,药品质量与生产过程中的每个环节密切相关。一、在线分析法与离线分析法

过程(process)是指将输入转化为输出的一组彼此相关的资源和活动,所有的工作都是通过一个过程来完成的。制药过程简单地说就是制药的生产流程。第一节概述

过程分析技术(processanalysistechnology,PAT)是指为确保最终产品质量,通过实时测量原料及其中间产物与过程的关键质量和效能特征(performanceattributes),对制药过程进行设计、分析和控制的系统。过程分析是一个完整的体系,对药品生产过程进行实时分析(real-timeanalysis),是制药过程分析的核心内容。制药过程分析可分为:离线分析(off-lineanalysis)近线分析(at-lineanalysis)连线分析(on-lineanalysis)在线分析(in-lineanalysis)

过程分析的类型与特点方法类型方法特点离线分析从生产现场采样后带回实验室进行处理和分析近线分析人工采样后在现场进行分析连线分析依靠自动采样系统,直接从生产流程抽取样品,自动输入分析仪器中进行连续或间歇连续分析。在线分析将监测探头插入生产流程中进行实时连续的分析

离线分析的工作方式在本质上和常规的分析检验工作没有太大区别,是制药工业过程控制的传统分析方式,目前在许多工厂仍大量使用。

近线分析是将分析仪器置于生产现场,就地取样、就地分析,加快了分析结果的报告速度。

连线分析是利用一套自动取样和样品预处理装置,将分析仪器与生产过程直接联系起来,实现连续的、自动的在线分析。

在线或称原位(in-situ)分析,是采用具有化学响应的传感器直接插入流程内,将探测讯号直接送到检测器内,并使检测器通过微机与控制系统相连接,以实现连续地或适时地、自动地监测与控制。按测试过程是否连续,在线分析法又可分为间歇式和连续式两种。二、制药过程分析的特点(一)分析样品的多样性

监控的工艺:样品可能来自于化学反应过程、提取分离过程、结晶过程、干燥过程、粉碎过程、清洁过程、制剂过程或包装过程等;

待测物的聚集状态:样品有气态、液态和固态;

生产阶段:样品可以是原辅料、中间体、包装材料和成品等。快速、简便、重现性好是制药过程分析的基本要求。(二)采样与样品预处理的特点1.采样

制药工业生产的物料数量大,组成不完全均匀,分析时只能从中选取少量样品,因此,在过程分析中保证采样的代表性就显得非常重要。采集原始数据混料压片包装一般基于实验室的分析过程为了减少风险传递到下一操作阶段,而在每阶段终点进行检测基于PAT分析过程采集原始数据混料压片包装为了减少风险传递到下一操作阶段,在每阶段中连续进行检测常规分析法与过程分析技术在片剂生产过程中不同的采样过程

采样根据样品的特点,可以使用手工和自动取样方式,在线分析一般采用的都是自动取样法。固体样品取样钻液体样品取样阀1-气体管道或容器;2-采样管;3-取样阀门气体样品采样装置1-气体管道或容器;2-采样管;3-过滤器;4-冷却器;5-导气管;6-冷却水入口;7-冷却水出口;8-冷却管2.样品预处理

样品预处理的目的是将样品处理成适宜的形式,以满足分析方法的要求。对固体样品一般要进行粉碎、过筛、混合、溶解等操作,对气体和液体样品一般要进行稳压、冷却、分离、稀释和定容等操作。自动采样与自动样品预处理是过程分析发展的方向之一。为达到制药过程控制连续和快速性的要求,在过程分析中常采用化学传感器(chemicalsensor)。

化学传感器是在分析仪器与分析样品之间实时传递选择性信息的界面,是一类能选择性地将分析对象的物理化学信息,如物理与化学性质、化学组成和浓度等,连续地转变为分析仪器易于测量的物理信号的装置。

光纤中光线的全反射示意图

化学传感器按检测功能分为湿度传感器、气体传感器、离子传感器和生物传感器等四类;按照基本的传感模式又分为热化学传感器、质量型传感器、电化学传感器和光化学传感器。(三)分析方法的快速性

药品的生产过程是指对药品的原料直接进行加工,将原材料转变成为原料药,或将原料药转变成为药品的过程。

生产过程中的每一个单元操作都可用合适的分析方法进行在线控制,不同的单元操作可采用不同的方法,一种分析方法也可在不同的单元操作中使用。固体制剂生产的单元操作中PAT应用制剂生产单元监测指标PAT混合混合均匀度、确定混合终点近红外光谱法、光诱导荧光法或热扩散法制粒含量均匀度、颗粒粒径和密度近红外光谱法、拉曼光谱法、聚焦光束反测量法、声学发射法干燥水分含量、确定干燥终点近红外光谱法整粒颗粒粒径分布、含量均一性激光衍射法、成像技术压片、装胶囊效价、含量均匀度、硬度、孔隙率和重量差异近红外光谱法、光诱导荧光法包衣判断包衣终点(衣膜的厚度和均匀度)、喷枪与片床的距离近红外光谱法、光反射法(四)化学计量学的重要性过程分析化学计量学(chemometrics)是过程监测和控制的软件系统,是PAT建立和发展的重要基础。

制药过程中常用的化学计量学方法:

主成分分析(principalcomponentanalysis,PCA)

主成分回归(principalcomponentregression,PCR)

多变量统计过程控制(multivariatestatisticalprocesscontrol,MSPC)

偏最小二乘法(partialleastesquaresmethod,PLS)聚类分析(clusteranalysis,CA)

人工神经元网络(artificialneuralnet,ANN)三、制药过程分析方法与仪器常见的在线分析方法方法类别分析方法色谱法气相色谱法、超临界流体色谱法、液相色谱法等光谱法紫外-可见分光光度法

、红外分光光度法、近红外分光光度法、X-射线光谱法、拉曼光谱法、荧光分光光度法、太赫兹技术、电感耦合等离子体发射光谱分析法等质谱法过程质谱法电化学检测方法电导式、电量式、电位式分析法磁学式分析法磁性氧分析法、磁共振波谱分析法传感器法生物传感器,物理传感器,化学传感器等热化学分析法热导式、热化式和热谱分析法形态学分析法聚焦光束反射测量法流动注射分析法紫外-可见分光光度检测、荧光分光光度检测以及多种电化学检测在线分析仪器是指能对试样的化学成分性质及含量进行在线自动测量的一类仪器。在线过程分析仪器有以下特点:1.过程分析仪器应有自动取样和试样预处理系统;2.过程分析仪器测量的准确度可以稍低一些,但稳定性必须要好,能够经受高温、高湿、腐蚀性、振动、噪声等恶劣工作环境的影响;

3.具有自动检错、报警和校正功能;4.结构简单,易于维护,价廉。过程分析仪器的组成过程分析仪器通常由五个部分组成:①取样装置与预处理系统;②检测器;③信号处理系统;④结果输出;⑤整机自动控制系统。第二节 光谱学分析方法

光谱学是利用物质对电磁辐射的吸收或发射现象来对物质的结构和组成进行研究的科学。光谱分析法是以物质分子和原子的光谱学为基础建立的分析方法。

利用物质粒子对光的吸收现象而建立起的分析方法称为吸收光谱法;利用发射现象建立的分析方法称为发射光谱法。一、紫外——可见分光光度法1.仪器结构制药过程分析中使用的过程分光光度计其光源、色散元件、光检测元件与分析型分光光度计基本相同,只是将试样池改为流通池式,它专门用于液体试样的分析。流通池比色法测定:由自动采样器把试样从生产工艺流程中取出,并进行过滤、稀释、定容等预处理,然后放入反应池中,加入显色剂等各种试剂,在电磁搅拌下反应完全后流入比色池进行测量。间歇式过程分光光度计检测系统2.应用紫外-可见分光光度法吸收光谱分析一般用于澄明的液体试样分析。由于Beer-Lambert定律在一定的浓度范围内吸光度值才与浓度呈良好的线性关系,故样品常需要进行过滤、稀释、定容等预处理。由于仪器本身无分离的能力,所以常用于组成较为简单,共存的物质对待测物无干扰或干扰可以忽略不计的样品。二、红外分光光度法

过程分析使用的红外光谱仪分为色散型红外光谱仪和傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR)。FT-IR主要部件包括:光源、干涉仪、样品池、检测器、计算机和记录仪等部分。FT-IR光谱仪的原理图R—红外光源;M1—定镜;M2—动镜;BS—光束分裂器;S—样品;D—检测器;A—放大器;F—滤光器;A/D—模数转化器;D/A—数模转化器FT-IR具备以下特点:(1)分辨率高:迈克尔逊干涉仪分辨率可达0.1cm-1,波数准确度高达0.01cm-1,动态准直干涉仪分辨率能力达到了0.09cm-1;(2)测定速度快:FT-IR在几十分之一秒内可扫描一次,在1s以内就可得到光谱图;(3)灵敏度高;(4)杂散光小:一般全光谱范围内的杂散光低于0.3%;(5)测定范围宽:改变光源和分光束可测量10000~10cm-1的红外光谱。2.应用(1)反应监测

一个连续的反应过程可分为稳定阶段和过渡阶段。在过渡阶段产品组分随着时间变化。使用FT-IR在线监测系统可以追踪过渡阶段瞬间的变化,及时调整工艺参数使反应顺利进行。FT-IR一般采用单变量分析(univariateanalysis)。单变量分析是在一个波数处建立吸收峰强度与待测物浓度或物理性质之间的关系。

色谱联用时,为了降低成本,加快信息获取的速度,文献报道可用多变量分析(multivariateanalysis)对检测信号进行数学处理。

多变量分析是在多个波数处建立起吸收峰强度与待测物浓度或物理性质之间的关系,采用数学统计的方法,如PCR、PLS等来获取待测物的信息。.(2)粒径和晶型测定

在原料药结晶、粉碎或混合等单元操作中,通过在线的红外光谱测定,可有效地监测粒径的分布和晶型的状态。

多晶型(polymorphs)是指一种物质由于在不同晶格中分子的排列和构象不同而存在的两种或两种以上晶型的现象。(3)水分和溶剂测定FT-IR已成功地运用在原料药、中间产品或晶体中水分或溶剂的定量检测。在离线分析中,常等生产结束后采用干燥失重等指标对成品进行控制,这样生产的风险较大,产品一旦不符合要求,就必须在规定的条件下进行重新干燥。采用在线FT-IR,在生产过程中控制水分和溶剂,减小生产风险,降低生产成本。三、近红外分光光度法1.基本原理(1)光谱产生近红外分光光度法(nearinfraredspectrometry,NIR)系通过测定被测物质在近红外谱区的特征光谱并利用适宜的化学计量学方法提取相关信息后,对被测物质进行定性、定量分析的一种分析技术。(2)测定模式NIR的常规分析技术分透射和反射光谱两类。透射光谱一般用于均匀透明的真溶液或固体样品;NIR漫反射光谱分析一般用于固体和半固体样品。

在透射模式中测量的是透光率(T),即给定波长处入射光穿过样品后衰减的强度。另一种透射测试为透反射。这两种情况,结果可以由透光率(T)或吸光度(A)表示。

T=I/I0

A=-1gT=1g(1/T)=1g(I0/I)

式中,I0为入射光强度;I为透射光强度。

在漫反射模式中测量的是反射率(R),即从样品反射回的光强度(I)与由背景或参考物质表面反射回的光强度(Ir)的比率。典型的近红外反射光谱可以通过计算,并以Ig(1/R)对波长或波数作图得到。

R=I/Ir

AR=1g(1/R)=1g(Ir/I)式中,I为从样品漫反射回的光强度;

Ir为从背景或参考物质表面反射回的光强度。

(3)影响因素影响近红外光谱的主要因素有样品温度、样品的含水量和残留溶剂、样品厚度、样品的光学性质、多晶型和样品的实际贮存时间等。除此以外,测定时间、人员的变化和仪器自身的漂移也会对近红外光谱的测定产生影响。

(4)基本流程NIR是一种间接测定方法,一般需先建立标准样品近红外光谱与待测组分含量的校正模型,然后将待测样品的近红外光谱数据代入校正模型,计算出其中待测组分的含量。近红外光谱分析的基本过程可分为以下几个步骤:①代表性样本的选择②标准值的测定③光谱采集④建模波数范围选择⑤光谱预处理⑥建立NIR模型⑦方法学验证

⑧定量校正模型评价⑨样品分析

对建立好的模型必须通过预测集(或称验证集)样本的预测来判断校正模型的质量,一般采用以下指标来评定。

相关系数(correlationcoefficient,R2),计算公式为:

交叉验证误差均方根(rootmeansquareerrorofcrossvalidation,RMSECV),计算公式为:

预测误差均方根(rootmeansquareerrorofprediction,RMSEP),计算公式为:

式中,Ci

为对照分析方法测量值;为通过NIRS测量及数学模型预测的结果;Cm为Ci均值;n

为建立模型用的训练集样本数;p为模型所采用的因子数;m为用于检验模型的预测集样本数。

相对预测误差(relativesuspectederror,RSE),计算公式为:2.

仪器和仪器性能指标

(1)仪器:近红外分光光度计由光源、单色器(或干涉仪)、检测器、数据处理和评价系统等组成。

(2)仪器性能指标的控制:使用在780~2500nm(按波数计为12800~4000cm-1)范围内具有特征吸收的合适的标准物质(例如含镝、钬、铒等稀土氧化物)进行波长校验,在校验的波长范围内至少需检查三个波长。

(3)线性和仪器响应值:用一组透射率或反射率已知的标准物质检查分光光度计的线性和仪器响应值的稳定性。

(4)噪声:用合适的反射标准物质或两个透射标准物质,一个相对高吸收率的标准物质、一个相对低吸收率的标准物质用于高、低通量下的噪声测试。当没有标准物质时,噪声测试利用100%吸收线测试。3.应用(1)定性分析可对药品的活性成分、辅料、制剂、中间产物、化学原料以及包装材料进行鉴别。采用NIR方法分析片剂中三种活性成份A—阿司匹林;B—咖啡因;C—布他比妥

在过程控制中,近红外光谱可以用于晶型和结晶性、多晶性和假多晶型性的快速鉴别。氢氯噻嗪与乳糖等赋形剂混合时NIR谱随混合时间的变化中药成分的分离和纯化过程也可采用NIR实现生产过程在线监测。柱色谱过程的NIR相似度趋势图

(2)定量分析:NIR可定量测定药品活性成分和辅料在生产过程中的变化含不同量活性成份的已包装片剂的NIR图谱1—空白片剂;2—含5%活性成份的片剂;3—含10%活性成份的片剂;4—含20%活性成份的片剂在化学药生产过程中主要应用有:化学反应程度和反应终点的判断、原辅料的粒度分布测定、干燥过程中水分的在线测定、压片过程中主成分的在线含量测定;在中药生产过程中主要应用有:中药材中主成分的快速测定、提取过程中主成分的变化、浓缩过程的在线控制等;在生化制药中,应用在线近红外分析仪可监控发酵反应过程中营养素的变化。还可用于测定某些脂肪类化合物的化学值,如羟值、碘值和酸值等,水分的测定,羟基化程度测定以及溶剂量的控制。近红外光谱可用于包装药品中活性成分的测定。在过程控制中,近红外光谱法可以用于原辅料及制粒颗粒的粒度测定;片剂厚度、溶出行为、崩解模式、硬度测定;薄膜包衣性质检测。

在过程控制中,近红外光谱法还可以用于中药生产工艺流程中的提取、浓缩、醇沉和干燥等过程的监控。浓缩过程近红外预测与实际测定趋势对照图四、拉曼光谱法

拉曼光谱(Ramanspectrometry

)是分子振动光谱的一种,属于散射光谱。拉曼散射效应是由印度科学家Raman于1928年发现的。拉曼光谱法和红外光谱法在化合物结构分析上各有所长,互相补充,两种光谱的结合,才能得到分子振动光谱的完整数据,更多地获得药品的质量信息。1.基本原理

当单色光(如激光)照射透明的样品时,大部分光透过样品,一部分光被样品吸收,而另一部分光会被样品在各个方向上散射。在这些散射中,散射光的频率(能量)与入射光的频率相同,则这部分散射光称为瑞利(Rayleigh)散射。有一部分被散射的光频率与入射光不同,频率发生了位移,这种散射称为拉曼(Raman)散射。瑞利和拉曼散射产生的原理图

从图可看出v反Stokes>v0>vStokes能级差为△E=hv0-hvStokes=hv反Stokes-hv0=E1-E0对应的Stokes线与反Stokes线的Raman位移相等,即:

拉曼位移=v0-vStokes=hv反Stokes-

v0=△E/h=(E1-E0)/h

上式表明拉曼位移的大小取决于分子振动能级的差值,拉曼位移在数值上取决于第一振动激发态与振动基态的能级差。不同的化学键或基团有不同的振动,拉曼位移反映振动能级的变化,是分子结构的特征参数,它不随入射光频率的改变而改变,故拉曼光谱可以作为分子结构定性分析。

拉曼谱线的强度与入射光的强度和样品分子的浓度成正比,若入射光强度一定,则只与样品浓度有关,故拉曼光谱可用于定量分析。

拉曼光谱图是以拉曼位移(波数)为横坐标,谱带强度为纵坐标作图得到的图谱。由于拉曼位移是以激发光波数作为零写在光谱的最右边,并省去反Stokes线相应的拉曼位移谱带,采用左正右负的坐标定位规则,因此便得到类似于红外光谱的拉曼光谱图。

分子的拉曼活性,取决于分子在运动时某一固定方向上的极化度是否改变。极化度是指分子在电场(如光波这种交换的电磁场)的作用下分子中电子云变形的难易程度。

在同一分子中,某个振动既可以具有拉曼活性,又可以具有红外活性;也可以只具有拉曼活性而无红外活性;或只有红外活性而无拉曼活性。对于全对称振动模式的分子,如含有C—C、S—S、N—N键等,在红外光谱上几乎看不到吸收锋,但在激发光子作用下,会发生分子极化,故常有拉曼活性,而且活性很强,故拉曼光谱和红外光谱是互相补充的。

拉曼光谱的优点:

(1)快速、准确,测量时通常不破坏样品(固体、半固体、液体或气体);

(2)样品制备简单甚至不需样品制备;

(3)谱带信号通常处于可见或近红外光范围,可以有效地和光纤联用。拉曼光谱的缺点:拉曼光谱有可能被荧光所湮灭检测不到样品的拉曼信号;不同振动峰重叠和拉曼散射强度易受光学系统参数等的影响;常出现曲线的非线性的问题;被测体系易受到污染,增加了引入误差的可能性;检测灵敏度低。2.仪器结构激光拉曼光谱仪可分为色散型激光拉曼光谱仪和傅立叶变换拉曼光谱仪。

色散型激光拉曼光谱仪主要由激光光源、样品池、单色器、检测系统、记录输出和计算机控制等部分组成。它逐点扫描,单道记录,为了得到一张高质量的谱图必须经多次累加,花费时间长。并且它所用的可见光范围的激光,能量大大超过产生荧光的阈值,易激发出荧光而掩盖拉曼信号,给测量造成困难。

傅里叶变换激光拉曼光谱仪消除了色散型拉曼光谱仪的缺点,无荧光干扰,信噪比高,扫描速度快,分辨率高,拓宽了拉曼光谱的应用范围。

傅里叶变换激光拉曼光谱仪由激光光源、样品池、迈克尔逊干涉仪、滤光片组、检测器及控制计算机等组成。傅里叶变换激光拉曼光谱仪光路图1—聚焦镜;2—Ge检测器(液氮冷却);3—介电滤光器;4—空间滤光片;5—动镜;6—分束器;7—定镜;8—样品;9—抛物面会聚镜;10—透镜;11—激光器

(1)激光光源:通常采用激光器为光源,产生近红外线或紫外-可见光作激发光。由于激发光能量低于荧光激发所需阈值,可避免大部分荧光对拉曼光谱的干扰。

(2)样品池:样品的放置方式有直接的光学界面、显微镜、光纤维探针和样品池等。样品池装有三维可调的样品平台、聚焦透镜和收集透镜。聚焦透镜使激光聚集在样品上产生拉曼散射;收集透镜收集由样品产生的拉曼散射光。

(3)干涉仪:与傅里叶变换红外使用的迈克尔逊干涉仪一样,只是将分束器改换成石英分束器。整个拉曼光谱范围的散射光经干涉仪,所得干涉图经计算机进行快速傅里叶变换后,即得到拉曼光谱图。用于制药过程分析的拉曼光谱仪扫描速度每分钟可得到20张谱图,大大加快了分析速度,并且通过多次累加,改善谱图的信噪比,提高了检测的灵敏度。

(4)滤光器:由于激光波长的散射光(瑞利光)要比拉曼信号强几个数量级,必须在浸入检测器前滤除。所以在拉曼光谱仪中设计有滤光器,滤光器由1~3个介电干涉滤光器组合而成,可进行分级滤光,滤出比拉曼散射强106~1010倍的瑞利散射。应用最为广泛的为陷波滤波器,它具有滤波效果好和体积小等优点。

(5)检测器:色散仪器中最为常用的检测器为硅质电荷耦合元件(CCD);傅里叶变换仪器常采用单通道锗或铟镓砷化合物(InGaAs)检测器以配合钕:钇-铝-石榴红(Nd:YAG)1064nm的激光器在近红外区使用。目前多采用可在室温下工作InGaAs检测器,也有采用灵敏度较高的液氨冷却的锗二极管检测器,但费用较高。3.应用

拉曼位移是分子结构的特征参数,当实验条件一定时,拉曼光谱的强度与样品的浓度呈现简单的线性关系,可用于有机化合物和无机阴离子的定性和定量分析。

拉曼光谱法可进行实时在线多点检测,提供制药工艺的动态信息,便于进行过程控制;一般不需要样品预处理,使用方便,节省时间;可进行远程测量,保护操作人员,适用于有毒、高温、高压或样品处于保护气体中而不宜于有人工干预的情况或危险的环境下进行测量;设备操作简单,维护方便。

常用的拉曼光谱分析技术有单通道和多通道技术、采用傅里叶变换的FT-Raman光谱分析技术、共振拉曼光谱分析技术和表面增强拉曼效应分析技术。

拉曼光谱也可与其它多种分析测试仪器联用,如拉曼与扫描电镜联用,拉曼与激光扫描共聚焦显微镜联用,拉曼与原子力显微镜/近场光学显微镜联用,拉曼与红外联用等。

(1)合成过程分析:在线拉曼光谱法可在药品生产过程中对产品成分和工作条件进行实时监测。将光纤探头插入反应容器中,不需取样分离就可远程监测化学反应中各组分的拉曼光谱随时间变化的关系曲线,经过偏最小二乘回(partialleastsquaresregression,PLSR)等数学处理,可得到反应物和生成物的浓度变化规律,进而对合成过程进行实时控制。

(2)药物多晶型分析:由于不同晶型可在拉曼光谱上显示出不同的吸收特性,所以Raman光谱法是药物多晶型测定和控制的有效手段。如:消炎镇痛药吡罗昔康,治疗消化道溃疡药物盐酸雷尼替丁多晶型的测定。与X-射线粉末衍射(X-raypowderdiffraction)和红外光谱相比,Raman光谱法灵敏度较高。图中1090.9cm-1和1081.3cm-1是晶型Ⅰ的特征峰,分析比较各产品的图谱可以看出七种产品均含有晶型Ⅰ。甲丙氨酯的三种晶型和七种片剂的拉曼光谱1~3为三种晶型;4~10为七种片剂

(3)含量测定:拉曼谱带的强度与待测物浓度的关系遵守比尔定律:Iv=KlcI0式中,Iv为一定波长处的峰强;K为仪器和样品的参数;l为光路长度;c为样品中特定组分的摩尔浓度;I0为激光强度。

(4)其它应用:拉曼光谱在制药生产过程中还可应用于多组分混合均一性判断及终点判断、混悬液均质化的在线过程控制、流化床制粒和干燥过程的在线监测、压片过程的在线监测、包衣过程的在线监测、冷冻干燥过程的在线监测、连续生产过程控制,另外,拉曼光谱还可用于发酵过程分析和药品辅料和包装材料分析。

色谱法是分析复杂混合物非常有效的手段。用于工业生产过程分析的色谱一般称为过程色谱(processchromatography)或工业色谱(industrialchromatography)。与常规的实验室分析不同,在过程色谱中,从样品采集、样品预处理到分析、检测、记录、显示等所有必要的操作大都是自动完成的。第三节

过程色谱系统

制药过程分析要求分析速度快,但过程色谱一般是间歇式循环分析。

为达到过程控制的目的,过程色谱的循环应尽可能缩短。主要通过多柱切换的方法,每根色谱柱分离几个特定组分,对过程控制有用的组分进行进一步分析,而不重要的组分则通过色谱柱组合技术予以排除。过程色谱常与其它分析技术联用以获得生产过程的定性和定量信息。1.仪器组成

过程色谱仪主要由取样与样品预处理装置、分析单元(包括进样器、色谱柱和检测器)和程序控制单元等几部分组成。预处理装置主要包括连续采样装置和样品气化、富集、预纯化装置,色谱仪则主要进行样品的分离、检测以及数据处理。预处理装置与色谱仪之间通过六通阀实现连接和切换。

(1)取样和样品预处理装置:

取样和样品预处理装置的基本功能是提供具有代表性的、适合色谱分析的样品。工作流程为从生产工艺物流中获取试样;对样品进行适当的处理,以满足色谱分析的要求;将经过处理的样品输送到色谱分析流路中。

建立取样和样品预处理方法应考虑三方面:样品理化性质、取样装置特性和色谱分析要求。色谱分析要求提供具有适当温度、压力、流量的样品,样品杂质和干扰成分应尽可能少、无腐蚀、不起化学反应。

样品预处理装置一般包括过滤器、调节器、控制阀门、转子流量计、压力表和冷凝器等部分。

气体样品的预处理系统1-减压阀;2-前置稳压装置;3,4-过滤器;5-稳压器;6-干燥器;7,8-调节阀;9-流量计

对于气体物流有简易的气体取样与预处理系统、能吸收干扰组分的的气体取样与预处理系统、隔膜泵气体取样与预处理系统和蒸汽喷射气体取样与预处理系统等。

对于液体物流有简易的液体取样与预处理系统、带有稀释和过滤装置的液体取样与预处理系统、反吹清洗液体取样与预处理系统和蒸汽加温液体取样与预处理系统等。具有稀释和过滤装置的液体样品预处理系统

(2)分析单元:分析单元中包括进样器、色谱柱和检测系统。

进样器的作用是在每一分析循环开始时将一定数量的样品注入色谱柱系统。进样器常用六通阀。六通阀有载样(load)和注入(inject)两个位置:在载样位置,样品进入定量管,而流动相直接流入色谱柱;在注入位置,流动相与定量管连接,将定量管中的样品冲入色谱柱。六通阀的原理图

在过程监测中使用的色谱仪,其分析系统中通常需采用两根或多根色谱柱,以提高色谱分离能力。系统中多根色谱柱之间的切换动作是通过切换阀来完成的。常用的切换阀结构有旋转活塞阀、膜片阀、环式柱塞阀和滑块式柱塞阀等。

柱子是过程色谱的核心部分,过程色谱的柱子按使用目的分为分离柱、保留柱、贮存柱和选择柱等。

分离柱连接分析通路中或切换阀的两个通道,起分离组分的作用;保留柱起阻留样品中某些组分的作用;贮存柱是按照预定程序,在规定时间将某些组分排除于分析系统之外;选择柱用于排除不需测定的高浓度组分而使待分析的低浓度组分进入分离系统。

检测器的目的是将各组分的浓度或质量转变成相应的电信号。过程色谱分析用的检测器种类较多,过程气相色谱常用热导检测器(TCD)和氢火焰离子化检测器(FID),有时也用密度检测器或质谱检测器;过程液相色谱常用紫外(UV)检测器和电化学检测器(EChD),也可用折光(RI)或蒸发光散射(ELSD)等通用型检测器。

(3)程序控制单元:程序控制单元是实现色谱循环分析的控制部分。程序控制单元的核心部分是程序器。在确定的分析循环周期内,程序器按照预先确定的分析程序向各部分发出动作指令,控制样品取样并进行样品预处理,完成样品注入、分析流路和色谱柱切换、信号衰减、基线校正、数据分析与存贮、流路系统自动清洗等控制动作。

按照结构程序器可分为:步进式程序器、凸轮式程序器和数字式程序器等类型。过程分析的程序控制单元还包括信息的传输和通信。数据转换器一般采用符合现场总线基金会规范的数字通信,并通过配套的硬件设备,实时转换为符合工业领域串行通信协议(modbus

)规范的标准串行数字通信。通过现场总线(fieldbus)/通用串行总线(USB)的转换器连接计算机,并通过软件迅速地得到包括色谱图在内的数据。2.应用

在过程色谱中较成熟的方法是气相色谱法,气-固和气-液色谱柱均有应用。气相色谱法常用于混合气体的分析,也可用于对热稳定的、易于气化的其他类型样品的分析,这些样品通过气体压力驱动注入气相色谱的气化室气化后进行分析。

受样品捕集、在线预处理、分析废液处理等限制,液相色谱法在过程分析中的应用不如气相色谱法广泛。

(1)药物中易挥发成份的分析:制药过程中易挥发成分如有机残留溶剂、药物包装材料中的易挥发单体可采用在线GC法监测。采用快速GC法可实现实时分析。快速GC分析中,常采用短柱,固定液涂布厚度小,并配以快速程序升温的方法。

目前,各种自动取样、进样技术如全自动顶空进样系统已经成熟,并已有商品化的仪器上市。

(2)合成过程监测:采用HPLC法可进行合成过程的自动监测。将自动取样装置装在反应器中取样,样品经过过滤、稀释和定容等操作,注入色谱柱进行分析。例如,文献报道用HPLC法,可以进行抗病毒药物azaaindole衍生物合成的监测、2,4-二硝基甲苯催化氢化单元中间体合成的监测,降低了生产过程的风险。

(3)发酵过程监测:将自动取样装置装在反应器上,自动从发酵罐中取样,采用HPLC法可以在线测定抗生素发酵过程的糖消耗量、生物发酵中的蛋白蛋/缩氨酸(肽)、介质、抗体等。

(4)反应废液分析:将取样装置连接在反应废液管道中取样,样品可不经过浓缩和净化,用离子交换色谱分析反应

废液中的有害离子浓度。

流动注射分析(flowinjectionanalysis,FIA)是在热力学非平衡条件下,在液流中重现地处理试样或试剂区带的定量流动分析技术。换言之,FIA就是采用把一定体积的样品注入无气泡间隔的流动试剂中,并保证混合过程与反应时间的高度重现性,在非平衡状态下所完成的定量测定方法。FIA打破了分析化学必须在物理化学平衡的条件下完成的传统,具有适应范围广、效率高、精度好、能耗低和仪器简单价廉等特点。第四节

流动注射分析法1.基本原理

流动注射分析的基本过程图:

样品阀(进样阀)把准确体积的样品溶液间歇而迅速地注入流速一定的连续载流中,随载流(carrier)进入反应器,在反应器中样品与载流混合,并与载流中的试剂发生反应,反应产物流经检测器时被检测,记录仪读出一峰形信号,峰高与样品的浓度成正比。在同样的条件下对照品同法操作,计算求得样品的含量。

在FIA中样品与载流(试剂)的混合是不会完全的,对一个固定的FIA装置来说,只要载流流速不变,样品与试剂混合模式不变,在相同的流路截面上,样品的分散状态是严格重现的,即使在非稳态状态下也可利用同样条件下样品与对照品测试结果对比进行快速、准确的定量分析。

样品在FIA系统中的分散过程就是样品的物理稀释过程,如图所示。

样品和试剂的分散状态常用分散系数来描述。分散系数是指在分散过程发生之前与之后,产生读出信号的流体元中待测组分的浓度比。D=Co/C

式中,D为分散系数;Co为样品未分散之前待测物浓度;C为分散后的某段流体元中的浓度。D的物理意义是测定的流体元中待测组分被载流稀释的倍数,显然,D是一个大于1的数值。

分散系数是指导FIA系统条件选择的一个重要参数。分散系数的大小由载流流速、管道长度、管径及形状、样品体积、样品及试剂分子的扩散系数等参数所决定。FIA体系设计的依据是分散原理,根据由峰最大值所得的分散系数的大小可以将FIA的流路划分为高(D>10)、中(D=2~10)、低(D=1~2)分散体系。

样品分散的程度可通过对管路系统参数的操纵来控制。在具体应用时,根据所确定的具体分析方案调整流路设置,改变相应部件的几何尺寸。低的分散可以通过增大注样体积、降低流速和使用短管路获得;反之,要获得大的分散,可以采用小样品体积,大流速和长管路来实现。2.仪器组成FIA由液体驱动装置(如蠕动泵)、进样阀、反应与连接管道、流通式检测器和工作站等部分组成。

(1)液体驱动传输设备

:液体驱动传输设备是FIA装置的核心部分,其作用是将试剂、样品等溶液输送到分析系统中。

理想的液体驱动和传输设备应具备以下特性:①能够提供重现性好、脉动小的液体输送,流速稳定;②可以提供多通道平行泵液通道;③易于调节流速;④化学稳定性好,能输送多种试剂和溶剂;⑤生产成本低,运行消耗少,易于维护。

液体驱动传输设备关键部件为恒流泵。目前以蠕动泵(peristalticpump)和往复式柱塞泵(reciprocatingplungerpump)用的较多。蠕动泵由泵头、压盖、调压器、泵管和驱动电机组成,它可提供多个通道,通过改变泵的内径得到不同的流速。往复式柱塞泵与HPLC的柱塞泵类似,只是工作压力低得多;与蠕动泵相比,往复式柱塞泵具有流速稳定性好,抗有机溶剂能力强的优点,尤其适合于在线分析。(2)进样阀:进样阀(injectionvalve)的作用是采集一定体积的样品(或溶剂)溶液,并以高度重现的方式将其注入连续流动的载流中。目前有六孔双层旋转进样阀和十六孔八通道多功能旋转阀等种类。

(3)反应与连接管道:FIA的各主要部件之间通过管道连接,管道按作用可分为采样环、反应管道和连接导管等。过程分析的样品种类很多,有的样品腐蚀性较强,故要求反应与连接管道应由耐腐蚀的聚四氟乙烯或聚氯乙烯管材料制成。

(4)流通式检测器:FIA系统可与多种分析检测手段形成高效率的分析系统,其中常用的检测方法有紫外-可分光光度法、荧光光度法、原子吸收光谱法、电化学分析法、化学发光法及酶分析法、免疫分析法、毛细管电泳等。

(5)工作站:主要是能自动探测和计算FIA峰的面积和高度的软件,有些还带有能控制外部设备,例如泵和自动取样器操作的扩展功能。3.操作模式FIA可以分为单道、多道和顺序注射(sequentialinjectionanalysis)等多种操作模式。单道模式:仅由一条管路组成,载液由单泵输送,当进样阀将样品注入管路后,含有试剂的载流将其载入反应管道,经过混合与反应后流入检测器检测。单道模式仅适合于单一试剂显色,并且试剂消耗量大,检测灵敏度较低。

流动注射分析的单道模式

多道FIA模式:载液和反应试剂通过不同管路输送,试剂与样品可通过对流与扩散相混合也可汇合到分散的样品带中,使混合更加均匀。多道模式样品在载流中的分散系数较低,检测灵敏度高,且试剂不必加在载液中,可节约分析成本。流动注射分析的多道模式

顺序注射模式:是采用一个多通道选择阀,选择阀上的各通道分别与试剂、样品、检测器等管路相连。泵将样品、试剂、载液等吸入贮存管中,然后输送至检测器进行检测。顺序注射模式具有控制更加简便、易于实现集成化和自动化、试剂和样品消耗少的特点。流动注射分析的顺序注射模式4.应用FIA可与分光光度法、原子吸收法、荧光光度法、化学发光法、电位法、安培法、伏安法等多种检测方法联用。紫外分光光度检测器因为结构简单、操作方便而被广泛使用,将传统比色池改成流通式,即可将普通分光光度计用于FIA

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