电泳学基础详解

第二章电泳学基础当前第1页\共有38页\编于星期三\6点一、定义及原理1、电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。2、原理电泳技术就是利用在电场作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、性状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的黏度成反比。3、应用：电泳技术除了用于小分子物质(无机盐、氨基酸、核苷酸、脂类)的分离分析外，最主要用于生物大分子(蛋白质、核酸、酶)的研究。当前第2页\共有38页\编于星期三\6点以生物大分子为例阐明电荷来源R╱╲COOHNH3+R╱╲COO-NH3+R╱╲COO-NH2+OH-

+H++OH-

+H+

pH>pIpH=pIpH<pI由于多数的电泳法设备简单，操作方便，并具有高分辨率及选择性特点，已成为生物化学与分子生物学中最常用技术之一。目前，电泳技术已广泛应用于分析化学、生物化学、临床化学、药理学、免疫学、微生物学、遗传学等科学中。当前第3页\共有38页\编于星期三\6点二、电泳分类（一）按有无固体支持物分类按有无固体支持物可以分为两类：自由电泳和支持物电泳。1、自由电泳即溶质在自由溶液中泳动。2、支持物电泳根据所用的支持物不同又可分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。3、根据支持载体的位置或形状可分成：水平电泳、垂直电泳、板状电泳、柱状电泳、U型管电泳、倒V字形电泳、毛细管电泳等。4、根据支持物的特点又可分为：①无阻滞支持物电泳。②高密度的凝胶电泳。当前第4页\共有38页\编于星期三\6点1、区带电泳2、等速电泳3、等电聚焦电泳4、免疫电泳（二）按分离原理分类当前第5页\共有38页\编于星期三\6点1、区带电泳在众多电泳技术中，最常用的为区带电泳，同时也是最简洁的电泳模式。推动离子/粒子作区带电泳的驱动力为电场力（F），离子/粒子所受电场力的大小与离子/粒子的净电荷（Q）和电场强度（E）呈正比关系，即：（2.86）而离子/粒子在运动时会受到一定的溶液阻力（F’），对于球形离子/粒子，此阻力服从Stoke’定律，即(2.87)在方程(2.77)中，r为离子/粒子的半径，η为溶液或介质的黏度，µ为泳动速度。泳动速度µ与离子/粒子的淌度m呈正比关系，即(2.88)当前第6页\共有38页\编于星期三\6点电泳淌度电泳淌度

(ElectrophoreticMobility)是单位场强下离子的平均电泳速度。因为电泳速度与外加电场强度有关，所以，在电泳中常用淌度而不用速度来描述荷电离子的电泳行为和特性。当前第7页\共有38页\编于星期三\6点当电泳达到稳态时，电动力等于介质的阻力，即F=F’。因此，我们得到

(2.89)

因此，将方程(2.78)和（2.79）的结合，我们得到

(2.90)

带电粒子的电泳淌度在一定条件下取决于粒子本身的性质，即与其所带电量成正比；与其半径及介质粘度成反比。当前第8页\共有38页\编于星期三\6点指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。06-02平卧式电泳槽装置示意图将滤纸条水平地架设在两个装有缓冲溶液的容器之间，样品点于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液润湿后，再盖上绝缘密封罩，即可由电泳电源输入直流电压（100V～1000V）进行电泳。（一）纸电泳当前第9页\共有38页\编于星期三\6点电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、电泳时间短、样品用量少。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。06-03血清蛋白的电泳图谱（二）醋酸纤维素薄膜电泳当前第10页\共有38页\编于星期三\6点由区带电泳中派生出一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式，被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳在板上进行，以凝胶作为介质。电泳中常用的凝胶为葡聚糖、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖。它具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小(1～100μg）、分辨率高等优点。

06-04凝胶电泳图（三）凝胶电泳当前第11页\共有38页\编于星期三\6点毛细管电泳的基本工作原理：溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离。

毛细管区带电泳是通过在充满电解质溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下，依迁移速度的不同而进行分离的。根据组分的迁移时间进行定性，根据电泳峰的峰面积或峰高进行定量分析。（四）毛细管区带电泳06-11毛细血管区带电泳原理图

当前第12页\共有38页\编于星期三\6点1.高灵敏度2.高速度3.高分辨率4.样品少5.自动化程度高6.应用范围广

06-10

英特雷勃——全自动电泳仪毛细管电泳的特点当前第13页\共有38页\编于星期三\6点实例区带电泳（CZE）分离硝基酚位置异构体1.了解CZE分离的基本原理2.了解电泳仪的基本构造；掌握其基本操作技术3.运用CZE分离硝基苯酚异构体当前第14页\共有38页\编于星期三\6点电泳分离分析装置示意图当前第15页\共有38页\编于星期三\6点电泳装置组成高压源系统：提供大小可变方向可控的直流电压分离系统：提供样品分离分析的通道和场所检测记录系统：实现对样品的检测与信号的记录当前第16页\共有38页\编于星期三\6点玻璃处理前：二氧化硅（SiO2)x石英玻璃毛细管内表面结构常用毛细管为石英玻璃毛细管经处理后石英玻璃毛细管内表面结构水解处理当前第17页\共有38页\编于星期三\6点pH>3Si-O-+H+Si-OH硅羟基的电离SiO-SiSiO-SiSiO-SiO-SiOOO-O-O-H＋H＋H＋H＋H＋H＋H＋毛细管内液体当毛细管内充满水时，会出现双电层：当前第18页\共有38页\编于星期三\6点SiOSiSiOSiSiOSiOSiOOOOOH＋H＋H＋Na+Na+Na+Na+毛细管内液体当毛细管内液体为pH7.0磷酸二氢钠与磷酸氢二钠缓冲液-电渗和电泳+当前第19页\共有38页\编于星期三\6点电渗

电渗是一种液体相对于带电管壁移动的现象。水合离子引起的流体整体移动。是毛细管内液体及其中所有组分共有的现象，包括溶剂、各种溶质（带电离子与中性分子）电泳

电泳是带电离子在电场作用下的定向移动。是毛细管内带电离子的特有现象，中性分子无电泳现象。当前第20页\共有38页\编于星期三\6点SiOSiSiOSiSiOSiOSiOOOOO-Na+Cl-电渗电泳电泳迁移速度Na+Cl-矢量速度合速度+当前第21页\共有38页\编于星期三\6点随着迁移速度不同，逐渐形成样品谱带,依次在检测窗口被检测Na+Cl--+当前第22页\共有38页\编于星期三\6点Na+Cl-Na+Cl--+当前第23页\共有38页\编于星期三\6点毛细管电泳区带电泳法分离硝基苯酚对硝基苯酚7.15邻硝基苯酚7.22间硝基苯酚8.39

pKa硝基苯酚的电离O-NO2OHNO2当前第24页\共有38页\编于星期三\6点电离后，硝基苯酚负电荷含量硝基苯酚受电场作用力pKa

对<邻<间Q对>邻>间F对>邻>间电泳速度对>邻>间电渗速度不变合速度对<邻<间出峰顺序：间、邻、对当前第25页\共有38页\编于星期三\6点2、等速电泳(ITP)等速现象：电泳静态达到后，被分离的离子淌度按顺序性梯形递减。1964年，由于Everaerts和Martin的重要贡献，ITP正式诞生。在研究中，他们发现在ITP达到静态后，所有被分离的离子以相同的速度移动。因此，他们命名这一分离工具为iso-tach-phoresis(iso=equal=相等，tach=velocity=速度，phoresis=electrophoresis=电泳)。当前第26页\共有38页\编于星期三\6点

1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子（置于一端的电泳槽中），试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。2.前导电解质的迁移率高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中移动，实现分离。等速电泳图示3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(ν=mE)，淌度大的离子区带电场强度小。当前第27页\共有38页\编于星期三\6点在等速电泳达到静态后，所有的被分离的区带以相同的速度向前移动，移动最快的离子为前导离子（leadingion），迁移最慢的离子为尾随离子（terminatingion），其它迁移速度介于两者之间的离子按速度大小依次分离。分离后的区带为近矩形，不同离子的区带与区带之间为“肩并肩”的形式。在等速电泳中，区带之间的界面是非常清晰的。这是由于存在“自校正效应”或“自锐利效应”。如果前导离子扩散进入邻近的区带，由于前导离子淌度高于邻近的离子淌度，在邻近区带内前导离子速度会高于邻近离子速度，结果扩散进入邻近区带的前导离子重新迁移回自己的区带。分析其它离子的扩散迁移会得到类似的结果。特点：界面明显，富集、浓缩作用。当前第28页\共有38页\编于星期三\6点等电聚焦电泳等电聚焦电泳（IFE，isoelectricfocusingelectrophoresis）：利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），最后，样品的各组分在各自的等电点聚焦成一条清晰而稳定的窄带。当前第29页\共有38页\编于星期三\6点Pr为两性电解质，不同Pr的pI不同，pI范围窄且净电荷为零，因此依pI分离Pr。EF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的pH梯度(连续的,稳定的,线性的pH)。当Pr在电场中迁移到它的PI时，由于净电荷为零，不再移动。如扩散，附近的凝胶会使其荷电阳、阴极会重新吸引它回到pI位置。因此Pr只能在pI位置被浓缩成窄、稳定的带。称这种浓缩效应为聚焦。只要凝胶中的pH梯度范围足够窄。便可将pI相近的Pr分开，EF是电泳技术中分辨率最高的技术。原理当前第30页\共有38页\编于星期三\6点关键：pH梯度的建立产生pH梯度的方法通常有两种：一种是用两种不同pH的缓冲液互相扩散，在混合区形成pH梯度，称为人工pH梯度。但这种pH梯度不很稳定，常用于制备电泳。另一种是利用两性电解质载体（Carrierampholytes）在电场的作用下自然形成pH梯度，称为天然pH梯度。方法当前第31页\共有38页\编于星期三\6点理想的载体两性电解质的合成用具有几个pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六胺）为原料，与不饱和酸（如丙烯酸）发生加合反应：加合反应优先加在α、β不饱和酸的β碳原子上，调节胺和酸的比例可以加上一个或多个羧基，这种合成方法与一般有机会合成不同，有机合成一般要求合成的产物愈纯愈好，而这里要求合成出的产物愈复杂愈好，要有多异构物和同系物，以保证的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值，从而得到平滑的pH梯度。载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围，分子量在300-1000之间。当前第32页\共有38页\编于星期三\6点等电聚焦电泳示意图上图左以A，B两种蛋白质为例，作出它们的净电荷曲线图，横轴代表环境中的pH值，纵轴代表蛋白質的净电荷，在pH6.5时，A带有两个正电荷，B带有一个负电荷。使A与B的净电荷为0的pH值分別为pH9和pH5，这就是它们的「等电点」。IEF是在具有pH梯度环境中进行的电泳。将蛋白质置于不同pH梯度的胶体进行电泳，它会朝着与自身所带电荷相反的电极方向移动，直到抵达等电点（pI）相同的pH值处才停止，如果它移到別的pH处，会因为带电而再度移动到和它pI相符的pH处。当前第33页\共有38页\编于星期三\6点当前第34页\共有38页\编于星期三\6点优点：①使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度；②由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；③电泳速度快；④分辨率高;⑤加入样品的位置可任意选择；⑥可用于测定蛋白质类物质的等电点；⑦适用于中