甲状腺癌功能性miRNA地鉴定、临床意义及其作用机制

甲状腺癌功能性miRNA的鉴定、临床意义及其作用机制开题报告人:王培松指导教师:陈光教授报告内容1.背景及选题依据2.研究目的及意义3.研究内容及关键问题4.研究方法5.研究条件6.研究进度及具体安排7.本题创新之处8.预期结果背景及选题依据甲状腺癌发病占甲状腺结节的5-20%、全身肿瘤的1.5%，是内分泌系统最常见的恶性肿瘤。近年许多资料显示甲状腺癌的发病率逐年上升,是近年备受关注的肿瘤之一,也是内分泌系统肿瘤领域的研究热点。2008年估计美国新发病例37340,1590人死于甲状腺癌。由于甲状腺癌多起病隐匿,常以无痛性甲状腺结节为最初临床表现,因此早期诊断较为困难。目前常用诊断方法包括触诊、超声、核素显像、细针穿刺细胞学活检等,其中细针穿刺细胞学活检是筛查和早期诊断甲状腺癌的有效方法,但仍然存在一定的假阴性率和部分无法确诊的病例,且需考虑患者的依从性。因此，研究鉴定早期诊断预警分子，是目前甲状腺癌临床研究所面临的瓶颈问题，有重要临床意义。越来越多的实验数据逐步建立了肿瘤与miRNA表达变化的关联，提示我们在不同的肿瘤中检测特定的miRNA的表达变化很可能成为肿瘤诊断、分期和预后预测的有力工具。但甲状腺癌中的miRNA尚知之甚少。研究目的及意义通过检测甲状腺良恶性肿瘤及其配对血清中miRNA的差异表达情况，分析与患者临床病理特征及其生存情况的相关性，鉴定出与甲状腺癌发生发展，特别是早期癌变密切相关的功能性miRNA。为通过检测新型miRNA开展甲状腺癌早期诊断及预后分级提供新途径。研究内容及关键问题1、研究候选miRNA在甲状腺癌中的表达特征与甲状腺癌发生发展的相关性。采用定量RT-PCR检测3-5个候选miRNA在30例甲状腺癌组织及癌旁正常甲状腺组织样本及30例良性甲状腺疾病组织中的表达；分析这些miRNA与甲状腺癌患者临床病理特征及其生存情况的相关性；在此基础上，从中筛选出1-3个具有重要临床意义的miRNA。2、检测不同临床分期，特别是早期甲状腺癌患者血清中的上述miRNA的表达变化规律，分析将这些miRNA作为甲状腺癌早期诊断预警分子的精准性。3、通过检测同一患者多发灶同一miRNA的表达，探讨其多灶性起源的原因。4、研究揭示具有重要临床意义的miRNA在甲状腺癌发生发展，特别是在早期癌变中的功能及其作用机制，为通过检测新型miRNA开展甲状腺癌早期诊断及预后分析提供新途径。通过BrdU和克隆形成等实验确定miRNA是否与甲状腺癌细胞的分裂增殖密切相关；通过细胞移动和细胞侵袭等实验确定候选miRNA是否在甲状腺癌细胞的侵袭和转移中发挥作用；最后通过定量RT-PCR和免疫印迹（westernblot）等技术手段，确定miRNA所调控的靶基因，确定作用机制。从甲状腺癌差异表达miRNA中，筛选出有重要临床意义者，进一步应用过表达与RNA抑制技术，开展miRNA功能研究，鉴定出功能性miRNA，是本项目的技术关键。为此，我们拟选取至少3种甲状腺癌细胞（ATCcelllinesARO、FRO、KTC-2(derivedfromanaplastictransformedPTC);PTCcelllinesNPA、TPC-1;)FTCcelllineWRO）和3种永生化正常甲状腺滤泡细胞(如HT-ori3、HEK293T等)，分别进行miRNA过表达或miRNA抑制实验，从正反多方面进行研究，可确保实验结果确切，说明问题有力。技术路线 miR-121、miR-122、miR-197miR-121、miR-122、miR-197、miR-346、miR-17-5p和miR-19a等6个候选miRNA660例甲状腺癌组织及癌旁正常组织样本及60例良性疾病组织（每份组织临床资料齐整且均有其术前血清）该部分工作已完成该部分工作已完成详见可行性分析详见可行性分析①定量RT-PCR检测定量RT-PCR检测60例甲状腺癌组织及癌旁正常组织样本及60例良性疾病组织（每份组织均有其术前血清）上述6个候选miRNA的表达量详见可行性分析②详见可行性分析②SPSS统计学软件分析SPSS统计学软件分析筛选出1筛选出1~3个与肿瘤分裂增殖、侵袭移动或不良预后相关的miRNA在甲状腺在甲状腺癌患者癌组织中下调的miRNA甲状腺癌患者癌组织中上调的miRNA1）miRNA抑制剂分别转染3种甲状腺1）miRNA抑制剂分别转染3种甲状腺癌细胞（该miRNA在这些细胞中高表达），下调该miRNA的表达；2）miRNA分别转染正常甲状腺上皮细胞（该miRNA在这些细胞中低表达）使miRNA的表达量升高1）miRNA分别转染3种甲状腺癌细胞（该miRNA在这些细胞中低表达），上调该miRNA的表达；2）miRNA抑制剂分别转染正常甲状腺上皮细胞（该miRNA在这些细胞中高表达）使miRNA的表达量降低详见可行性分析③详见可行性分析③分析细胞移动和侵袭能力(分析细胞移动和侵袭能力(Chamber移动实验和侵袭实验)分析细胞分裂增殖能力（BrdU实验和克隆形成实验）详见可行性分析④详见可行性分析④不同临床分期，特别是早期甲状腺不同临床分期，特别是早期甲状腺癌患者血清中上述miRNA的表达变化规律miRNA靶基因的表达（定量RT-PCR和免疫印迹）鉴定出与鉴定出与正常甲状腺上皮癌变、早期癌变、甲状腺癌细胞分裂增殖、移动和侵袭等肿瘤生物学行为密切相关的功能性miRNA并鉴定其在多灶性甲状腺癌中的表达情况研究进度及具体安排2010年2月至2010年7月，临床标本资料收集整理。2010年7月至2010年10月定量RT-PCR检测候选miRNA在30例甲状腺癌组织及癌旁正常组织样本及30例良性疾病组织（每份组织均有其术前血清）中的表达量，并分析它们的表达与患者的临床病理特征及其生存情况的相关性，筛选出1-3个具有潜在临床意义的miRNA。2010年10月至2010年12月，鉴定具有潜在临床意义的miRNA（1-3个）在甲状腺癌发生发展中的功能及其作用机制。在课题实施过程中，根据课题进展情况，随时总结实验结果，撰写研究论文。研究条件吉林大学第一医院甲状腺外科每年可完成数百例（400例以上）甲状腺癌切除手术，本试实验新鲜标本来源充足吉林大学第一医院病历资料系统吉林大学第一医院病理资料库吉林大学白求恩基础医学部生化实验室吉林大学第一医院病理科高年资医师阅片本题创新之处及成果价值1.发现某种新型的miRNA类甲状腺癌早期诊断预警分子。研究鉴定早期诊断预警分子，对甲状腺癌早期诊断有重要临床意义。针对这一突出临床问题，本研究拟通过检测甲状腺良恶性肿瘤及其配对血清中miRNA的差异表达情况，揭示它们在甲状腺癌发生发展，特别是在早期癌变中的功能及其临床意义。在研究过程中将可能发现某种新型的miRNA类甲状腺癌早期诊断预警分子或甲状腺癌的肿瘤特异性标志物，因此本项目的创新性十分明显。2.从血清中鉴定出新型miRNA类甲状腺癌早期诊断预警分子。miRNA在其它肿瘤患者血清中表达情况已有报道，但在甲状腺疾病中的研究很少，本项目在检测甲状腺良恶性肿瘤中miRNA的差异表达情况同时检测其配对血清中miRNA的差异表达情况，未来有望通过检测血清miRNA来早期发现甲状腺肿瘤。3.首次通过同一患者多发灶miRNA表达差异性情况，验证其多灶性起源问题。多发病灶是甲状腺乳头状癌的临床特征之一，文献报道发生率为18％～87％。多发病灶具有更高的恶性特征，表现为颈淋巴结转移及甲状腺外浸润的比例更高；多灶源于腺内转移还是多克隆起源目前仍有争议。本项目首次通过同一患者多发灶miRNA表达差异性情况，验证其多灶性起源问题。4.在获得甲状腺癌差异表达新miRNA的基础上，率先研究揭示这些miRNA分子在甲状腺癌中的功能及其作用机制。由于研究起步较晚，迄今为止，在甲状腺癌中，作为一类具有重要调控功能的小R