鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范

鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范范围本标准规定了鸭新型呼肠孤病毒病的临床诊断、实验室诊断和综合判定技术规范。本标准适用于鸭新型呼肠孤病毒病的诊断和流行病学调查。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范术语和定义下列术语和定义适用于本文件。鸭新型呼肠孤病毒病又称“肉鸭脾坏死症”、“番鸭出血性坏死性肝炎”，是由鸭新型呼肠孤病毒引起的多品种雏鸭脾脏出血和坏死为主要特征的疾病。该病毒在血清学和基因序列上与原有的番鸭呼肠孤病毒有明显差异。临床诊断流行病学该病一年四季均可发生，不同品种的鸭均可发病，如樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭、半番鸭等；发病日龄一般为5～25日龄，其中以5～10日龄居多，病程5～7天。临床症状病鸭精神沉郁，发育不良，部分拉白色稀粪，一般不会出现神经症状，容易继发鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌等细菌感染。发病率5%～35%，死亡率20%以下。病理变化脾脏表面出血或坏死是其主要病变特征。结果判定符合4.1流行病学特征，病鸭出现4.2临床症状和4.3病理变化，可判为鸭新型呼肠孤病毒病疑似病例，应进行实验室确诊。实验室诊断除非另有规定，实验室诊断所用化学试剂均为分析纯；试验用水符合GB/T6682二级水的规定；实验室生物安全要求按照GB19489执行。病原分离鉴定仪器和设备高速冷冻离心机。恒温培养箱。试剂或材料青链霉素（青霉素10000IU/mL，链霉素10000µg/mL）。0.22µm微孔滤器。8日龄～9日龄鸭新型呼肠孤病毒抗体阴性鸭胚。病料处理按NY/T541要求无菌采集发病鸭的脾脏1g～2g，加入10倍体积生理盐水和终浓度2000IU/mL的青链霉素，剪碎后充分研磨，反复冻融2次～3次，8000×g离心20min，取上清液用0.22µm微孔滤器过滤，经菌检无菌后用于病原分离。操作步骤取5.1.3中处理好的上清液经尿囊腔接种8日龄～9日龄鸭新型呼肠孤病毒抗体阴性鸭胚，0.1mL/枚，共5枚。封口后置于37℃恒温箱继续孵化，每XX胚两次，记录鸭胚死亡情况，观察到第6天。弃掉接种后24h内死亡的鸭胚，若接种6天内鸭胚出现死亡，则收集死亡鸭胚的尿囊液，用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法进行鉴定；若接种6天内鸭胚不出现死亡，则收集6天活胚的尿囊液，用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法进行鉴定。结果判定阳性：接种后死亡鸭胚或接种后6天活胚的尿囊液用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法检测为阳性。阴性：接种后死亡鸭胚或接种后6天活胚的尿囊液用5.2、5.3、5.4中的任意一种方法检测为阴性。RT-PCR方法仪器和设备高速冷冻离心机。PCR扩增仪。电泳仪。紫外分析仪。试剂或材料TRIZol。无RNA酶水。反转录酶M-MLV。RNA酶抑制剂。Taq酶。X脂糖。GoldviewDNA染料。阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。阴性参照物（阴性尿囊液）。操作步骤样品处理按NY/T541要求无菌采集发病鸭的脾脏1g～2g，加入10倍体积生理盐水，用剪刀剪碎后，置于研磨器中充分研磨，反复冻融2次～3次，8000×g离心10min，取上清液100μL用于RNA提取。RNA提取在100µL病料上清液中加入1mLTRIZol，剧烈颠倒50次～100次，室温静置10min后，加入200µL氯仿，上下颠倒50次～100次，室温静置5min～10min，12000×g离心10min。吸取上清加入等体积氯仿，上下颠倒50次～100次，12000×g离心10min。吸取上清加入等体积的异丙醇，轻轻混匀后，-20℃静置至少30min，然后12000×g离心15min～20min。弃上清液，加入1mL75%酒精，12000×g离心5min～10min。弃上清液，倒置自然晾干，或12000×g再离心5min，吸掉管底部的液体。沉淀用20µL无RNA酶水溶解，备用。阳性和阴性参照物RNA的提取同上。样品RNA提取也可使用同等效果的商品化试剂盒。引物上游引物P1：5'TCATTCATTTGGGCAGCGG3'下游引物P2：5'AGTAGTGTGTAAAGCATGGACT3'RT-PCR扩增反转录（RT）反应反应体系为10µL。在PCR管中加入dNTP（10mmol/L）0.8µL，引物P1（20µmol/L）0.5µL，引物P2（20µmol/L）0.5µL，RNA5.0µL，放PCR仪中70℃作用5min，然后取出冰浴1min～2min，再加入RNA酶抑制剂（40U/µL）0.5µL，反转录酶M-MLV（200U/µL）0.7µL，5×M-MLVbuffer2µL，继续放PCR仪中42℃30min，95℃2min。PCR扩增反应体系反应体系为50µL，配制见表1。PCR反应体系配制反应体系中各成分每个样品反应组分用量/µL10×PCRbuffer4.520µmol/L引物P10.520µmol/L引物P20.5RT产物5.05U/µLTaqE0.5ddH2O39.0总体积50.0反应程序采用以下反应程序进行扩增：第一阶段：95℃3min；第二阶段：95℃20s，55℃20s，72℃30s，共进行30个循环；第三阶段：72℃10min。RT-PCR扩增也可使用商品化的RT-PCR试剂盒，按说明书要求操作。电泳取PCR扩增产物6µL与10×上样缓冲液1µL混合，加入到1.5%的X脂糖凝胶孔中，同时在旁边点样孔中加入2000bpLadderMarker（分子量标准物）10µL，以5V/cm电压进行电泳25min～30min，在紫外分析仪上观察结果。结果判定试验成立条件在阳性对照出现一条大小226bp的单一条带，同时阴性对照无此条带的情况下，检测结果成立。结果判定被检样品出现与阳性对照同样大小的条带时，判为阳性；被检样品未出现与阳性对照同样大小的条带时，判为阴性。参见附录A。荧光RT-PCR方法仪器与设备高速冷冻离心机。荧光定量PCR扩增仪。试剂或材料TRIZol。无RNA酶水。SYBRGreen荧光RT-PCR反应液（2×SYBRPremix）。阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。阴性参照物（阴性尿囊液）。操作步骤样品处理参见5.2.3.1。RNA提取参见5.2.3.2。引物上游引物P3：5'ATCGCACTATTGACGCACTT3'下游引物P4：5'TTGACGACGCCAATCCC3'荧光RT-PCR扩增反转录（RT）反应参见5.2.3.4.1。荧光PCR反应体系反应体系为25.0µL，配制见表2。荧光PCR反应体系配制反应体系中各成分每个样品反应组分用量/µL2×SYBRPremix12.520µmol/L引物P30.520µmol/L引物P40.5RT产物1.0ddH2O10.5总体积25.0反应程序采用以下反应程序进行扩增：第一阶段：95℃45s；第二阶段：95℃10s，56℃10s，72℃15s，40个循环，每次循环在72℃延伸时收集荧光。荧光RT-PCR扩增也可使用商品化的Real-timeRT-PCR试剂盒，按说明书操作。反应结束后根据分析软件得出的Ct值和扩增曲线来判XX果。结果判定试验成立条件在阳性对照的Ct值≤33且出现典型扩增曲线，阴性对照Ct值≥35的情况下，试验成立。结果判定当被检样品Ct值≤33且出现典型扩增曲线时，判为阳性；当被检样品无Ct值或者Ct值≥35时，判为阴性；当被检样品Ct值在33-35之间时判为可疑，需重做，再次检测结果的Ct值＜35，且出现典型扩增曲线，则判为阳性，否则判为阴性。参见附录B。RT-LAMP方法仪器与设备高速冷冻离心机。水浴锅。紫外分析仪。试剂或材料TRIZol。无RNA酶水。甜菜碱（betaine）。TritonX-100。反转录酶AMV。RNA酶抑制剂。BstDNA聚合酶。SYBRGreenⅠ染料。阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。阴性参照物（阴性尿囊液）。操作步骤样品处理参见5.2.3.1。RNA提取参见5.2.3.2。引物RT-LAMP检测引物序列见表3。RT-LAMP引物序列引物名称序列（5’-3’）NDR-F3TGAGATATATTAGGGTGGGTCNDR-B3GACATGCCTAGTATGGAGCATNDR-FIPagcgatatcctgaggttgctTTTGCCATTGCTCTGCATGTCNDR-BIPaggcgaggatatgacgcTTTTCATCGATCATCTTCCAACCCRT-LAMP扩增反应体系反应体系为25.0µL，配制见表4。RT-LAMP反应体系配制PCR反应体系中各成分每个样品反应组分用量/µL10×Bstbuffer2.510mmol/LdNTP1.025mmol/LMgCl23.05mol/LBetaine2.010µmol/L外引物NDR-F30.510µmol/L外引物NDR-B30.540µmol/L内引物NDR-FIP1.040µmol/L内引物NDR-BIP1.040U/μLRNA酶抑制剂1.05U/μL反转录酶AMV1.08U/μLBstDNA聚合酶1.0RNA5.0无RNA酶水5.5总体积25.0反应程序采用以下反应程序进行扩增：第一阶段：63℃45min；第二阶段：85℃2min。结果判定试验成立条件反应结束后，取1μL10倍稀释的SYBRGreenⅠ加入产物中，混匀后在紫外线下观察。在阳性对照出现黄绿色荧光，同时阴性对照不出现黄绿色荧光的情况下，试验成立。结果判定在紫外线下被检样品出现黄绿色荧光，判为阳性；在紫外线下被检样品未出现黄绿色荧光，判为阴性。参见附录C。综合判定符合临床诊断规定的疑似病例经5.2、5.3、5.4中的任一方法检测，结果为阳性者，可判定为鸭新型呼肠孤病毒病。

（资料性附录）

RT-PCR结果电泳图RT-PCR结果电泳图见图A.1。说明：M——