陈楠超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）地生产

项目四：超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的生产

任务１：ＳＯＤ制备方案的制定

生药１１２１

２０１１４２３２０１

陈楠

SOD中文名称：超氧化物歧化酶英文名称：superoxide

dismutase;SOD

定义：编号：EC1.15.1.1。催化超氧化物自由基O－2和氢离子反应形成过氧化氢和分子氧的酶。应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科）历史1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶,开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。超氧化物岐化酶（SuperoxideDismutase），简称SOD，ECl.15.1.1，它催化如下的反应：

2O2-+2H+→H2O2+O2O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内的过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）会立即将其分解为完全无害的水。这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。自由基自由基（FreeRadical）是一类非常活跃的化学物质，是个有不成对（奇数）电子的原子、原子团、分子和离子。其中最重要的是氧自由基，它可聚集在体表、心脏、血管、肝脏和脑细胞中。如果它沉积在血管壁上，会使血管发生纤维性病变，导致动脉管硬化，高血压，心肌梗塞；沉积在脑细胞时，会引起老年人神经官能不全，导致记忆、智力障碍以及抑郁症，甚至老年性痴呆等，是造成人类衰老和疾病的元凶。氧自由基⑴无机氧自由基：超氧自由基、羟基自由基⑵有机氧自由基：过氧自由基、烷氧自由基、多元不饱和脂肪酸自由基RUFA、半醌自由基。另外，单线态氧1O2、H2O2、NO2、NO等分子虽然没有奇数电子，但氧化能力强，因此有人把它们和上述氧自由基放在一起，统称为活性氧。世界各国对“超氧化物歧化酶”的作用认定美国注册专利号为（CN1152337A）：用于预防和治疗大脑局部出血、溃疡、消除炎症、心率失常、浮肿、中毒、风湿、类风湿、风湿性关节炎、放射性损伤、药物中毒等症。法国注册专利号为（CN1167441A）：用于预防和治疗特异性脑损伤、非特异性脑损伤而引起的脑功能识别障碍。欧洲注册专利号为（499621）：用于预防和治疗癌症及术后放、化疗带来的脑损伤，抑制癌细胞再形成或扩散。日本注册专利号为（4327541，4312533）：用于治疗器官移植后的抗免疫反应具有奇效。用于治疗大脑局部出血导致神经坏死，防止半身不遂的治疗药物。对人体的作用

抑制心脑血管疾病抗衰老防治自身免疫性疾病肺气肿辐射病及辐射防护老年性白内障抗氧化预防慢性病抗疲劳消除副作用避免二次伤害化解女性的危机有效降低血脂、胆固醇、血压抗辐射增强肝肾功能对糖尿病有明显的恢复作用。

应用领域1.药物类主要集中在炎症病患者，尤其治疗类风湿关节炎、慢性多发性关节炎、心肌梗塞、心血管病、肿瘤患者以及放射性治疗炎症病患者2.生化制药作为一种生化酶制剂，广泛应用于临床和科研上，可抗衰老，抗肿瘤、调节人体内分泌系统3.化妆品可添加在化妆品中，具有抗氧化抗腐蚀的优良性能。以SOD为主要成份的化妆品风靡世界，引发了化妆品历史上的一场革命，使人类永葆青春美丽梦想成真4.保健食品、饮料

SOD糖、SOD口服液、SOD干啤等都非常畅销。在饮料、糖果、糕点等食品中加入SOD既可利用其抗腐蚀性延长保质期，又可调节人体内分泌系统。剂量与用法

肌注，慢性风湿性关节炎，8mg/次，3～4次/周。关节腔内注射：骨关节炎，2mg/次，每2周1次。深部皮下注射：放射性膀胱炎，4mg/次，在放疗后15～30分钟注射。副作用肌注偶见注射局部疼痛、荨麻疹、蛋白尿。材料啤酒废酵母试剂：甲苯、氯仿、凭水乙醇、异丙醇、丙酮、磷酸二氢钾、ＥＤＴＡ、邻苯三酚等均为分析纯。酵母培养基（％）：麓蓬糖8，蛋白质1，酵母膏1。灭菌条件：１２１℃．３０ｍiｎ提取SOD工艺流程

酵母泥

洗涤

酵母培养基灭菌酵母菌复壮

SOD纯化SOD提取实验过程一、废酵母的预处理二、酵母的复壮培养三、酵母中SOD的提取——异丙醇法四、SOD纯化啤酒废酵母菌等量无菌冰水混匀80-100目筛离心分离沉淀注入无菌冰水摇匀静置3～4h倾去上层悬浊液冰水漂洗直到所得上层清液无色无味酵母呈纯白色为止一、废酵母的预处理葡萄糖8%蛋白胨1%酵母膏1%蒸馏水1000ml121℃灭菌20min按30％接种量接入经过洗涤后的酵母恒温摇床培养28℃140r/min2h二、酵母的复壮培养搅拌120min离心除去菌体SOD粗提液每1g酵母湿细胞中加入9mL异丙醇加入三倍体积的50mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0）浸泡120min抽滤除去溶剂三、酵母中SOD的提取——异丙醇法

SOD粗提液用2mol/LHCl调节pH至5.0加入丙酮搅拌摇匀离心（5000r/min）上清调pH到4.0加入丙酮二次沉淀离心（5000r/min）SOD纯化产品SOD的等电点在pH4.0左右，而杂蛋白在pH5．0时沉淀量很多，因此提取时将pH调节到5四、SOD纯化注意事项丙酮分级沉淀操作时，宜在4～10℃条件下进行，有利于提高蛋白沉淀效果，保护酶活性。

提取SOD后的酵母残渣及杂蛋白可考虑加工为饲料或饲料蛋白添加剂，真正达到清洁生产的目的。

为降低成本，异丙醇均可考虑回收浓缩循环使用。

SOD活性测定采用改进的微量邻苯酚自氧化法。

提取条件的研究1.细胞破壁方法分别对比了甲苯法、乙醇-氯仿法、异丙醇法。异丙醇法得到的SOD酶活最高。2.异丙醇浓度的确定

90%的异丙醇提取得到的酶总活力最高3.最佳提取时间

SOD的释放量随着提取时间的增加而增加到一定的数量后，增加量减慢。120min提取量和设备利用率都得到保证。4.最适提取pH的确定

在pH7.0时总酶活最高

5.SOD最佳纯化条件的确定

pH为5.0，丙酮的浓度控制在丙酮：粗酶液(v/v)=0.8:1时，杂蛋白沉淀最多，SOD纯化最好．SOD酶比活最高。6.不同丙酮浓度对SOD沉淀纯化的影响采用丙酮：SOD清液为0.3:1的比例所获得的SOD沉淀酶比活最高，因此