荧光光谱分析方法及原理课件

参考书赵南明,周海梦.生物物理学,高等教育出版社,2000EmissionSpectroscopy,Chapter11,inK.E.vanHolde.W.C.JohnsonandP.S.HoedsPrinciplesofPhysicalBiochemistry,Prentice-Hall1998某些物质被一定波长的光照射时,会在一定时间内发射出波长比入射光长的光,如果这个时间比较短,这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿物——茧石fluospa)而得名。我们这里要介绍的荧光,是指物质在吸收紫外光和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光除了紫外光和可见光可能激发荧光外,其它的光如红外光、X射线也可能激发出荧光,因此除紫外荧光或可见荧光外,还有红外荧光、X射线荧光等。IndiscussingabsorptionwehavebeenconcernedentirelywiththeexcitationofamoleculefromitsgroundstatetoahigherenergylevelandhavegivennoconsiderationtothesubsequentfateoftheexcitedmoleculeInmanycasesthesequelisnotveryinterestingtheenergyistransferredasheattothesurroundingsInsomecaseslightisemittedbythesampleeitherasfluorescenceorphosphorescenceWewilldiscussthegeneralcharacteristicsofemissionandignoretheexceptions荧光光谱的特点FluorescenceisatechniquefordetectingbiologicalmaterialsBarakandWebbdemonstratedthatboundtolowdensitylipoproteinmoleculescanbedetectedoncellsurfacesbymicroscopyusingasensitivevideocamera.Withevenmoresophisticatedmethodsothershavemovedtowarddetectionofsinglefluorophoremoleculesinalaser-excitedflowstream.Becausethissensitivitycancombinewitheaseofuseandthepotentialformultiparameteranalysis,fluorescencehasbecomewidelyusedinbiologyandmedicine荧光光谱灵敏度高的原因荧头七辐射的波长比激发光浪长长,测量到的荧光频率与入射光的频率不同;荧光在各个方向上都有发射,因此可以在与入射光成直角的方向上检测这样,荧光不受来自激发光的本底的干扰,灵敏度大大高于紫外可见吸收光谱,测量用的样品量很少,且测量方法简便。荧光光谱第二个特点是荧光光谱能提供较多的参数,例如激发谱、发射谱、峰位、峰强度、荧光寿命、荧光偏振度等。荧光光谱还可以检测一些紫外-可见吸收光谱检测不到的时间过程过程。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁,荧光产生包括两个过程:吸收以及随之而来的发射。每个过程发生的时间与跃迁频率的倒数是同一时间量级(大约1015秒),但两个过程中有一个时间延搁,大约为10秒,这段时间内分子处于激发态。激发态的寿命取决于辐射与非辐射之间的竟争。由于荧光有一定的寿命,因此可以检测一些时间过程与其寿命相当的过程。例如,生色团及其环境的变化过程在紫外可见吸收的10秒的过程中基本上是静止不变的,因此无法用紫外可见吸收光谱检测,但可以用荧光光谱检测基本原理fluorescence系间交连三线态(10°-1)102s-)电子能级基态Fluorescenceisemissionfromasingletstatewheretheelectronspinsinthemoleculearepairedfuorescenceexcitationbyabsorptionofenergylosesenergyasheatbyinternalconversionthemoleculehesitatesatthelowestvibrationallevelofthefirstsinglet,becausearelativelylargeamountofenergymustbelosttogotothegroundstateduringthishesitationoneofthreethingsmayhappenithemoleculemayfluoresceitmayconv