第四章抗体制药1

本章目的要求1、掌握单克隆抗体的概念。2、理解制备单克隆抗体的一般流程。3、理解基因工程抗体的制备。4、理解噬菌体抗体库的基本方法、技术特点及基因工程抗体的表达。5、掌握抗体诊断试剂的分类。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第1页\共有52页\编于星期六\18点学习内容（一）1、抗体制药概述2、单克隆抗体制备的基本过程。3、基因工程抗体。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第2页\共有52页\编于星期六\18点第一节概述♠1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。♠1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性主要存在于γ球蛋白组分。♠70年代中期，日本利根川进证实了Ig的基因结构，获得1987年的theNobelprize。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第3页\共有52页\编于星期六\18点抗体？是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。抗体的产生？机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第4页\共有52页\编于星期六\18点抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第5页\共有52页\编于星期六\18点20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白，统称为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第6页\共有52页\编于星期六\18点多克隆抗体polyclonalantibody指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异性抗体）。实际意义：（1）预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清抗破伤风，副作用：超敏反应（2）临床诊断，如：肥达氏反应--伤寒、副伤寒缺点：特异性差。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第7页\共有52页\编于星期六\18点传统抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234脾脏淋巴結B细胞抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第8页\共有52页\编于星期六\18点单克隆抗体

monoclonalantibody，McAb1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体。单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的发展。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第9页\共有52页\编于星期六\18点第二节McAb及制备一、McAb1、McAb定义

是由一个杂交瘤细胞及其后代所产生的针对一个抗原决定簇的高度特异性和专一性的抗体。2、McAb怎样产生？

是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第10页\共有52页\编于星期六\18点二、McAb的制备1、抗原与动物免疫制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。有的抗原可以用化学合成：地高辛多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第11页\共有52页\编于星期六\18点为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫动物也采用相应的品系。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第12页\共有52页\编于星期六\18点免疫方法采用体内免疫法和体外免疫法。

体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8～12周龄雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔10个细胞进行初次免疫，间隔1～3周，再追加免疫1～2次。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第13页\共有52页\编于星期六\18点可溶性抗原按每只小鼠10～100

μg抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔2～4周，再用不加佐剂原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，刺激B细胞分裂。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第14页\共有52页\编于星期六\18点脾内免疫法即在麻醉下直接将0.1～0.2ml抗原注入脾脏进行免疫。细胞抗原需105个，可溶性抗原需10μg。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第15页\共有52页\编于星期六\18点

体外免疫法用于不能采用体内免疫的情况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫源性极弱，易引起免疫抑制。优点：需抗源量少，免疫期短，干扰因素少。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第16页\共有52页\编于星期六\18点体外免疫法：用4～8周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.5～5μg/ml,在5%CO237C下培养4～5天,再分离脾细胞,进行细胞融合。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第17页\共有52页\编于星期六\18点2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养细胞融合的方法脾细胞（1×108）骨髓瘤细胞（2～3×107）混合聚乙二醇诱导下融合，2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。P25抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第18页\共有52页\编于星期六\18点PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为40%~50%，相对分子质量4000为佳。相对分子质量在400~6000，浓度在10%~60%范围内的PEG都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在PEG溶液中加入DMSO，以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第19页\共有52页\编于星期六\18点用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有融合率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长期稳定。细胞融合后可产生多种融合脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合细胞如何去除脾-瘤以外的融和细胞？选择性培养－脾-瘤培养基为HAT培养液。次黄嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。A阻断DNA合成。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第20页\共有52页\编于星期六\18点抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第21页\共有52页\编于星期六\18点3、筛选阳性克隆与克隆化筛选阳性克隆常用检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第22页\共有52页\编于星期六\18点常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培养液。软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培养。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第23页\共有52页\编于星期六\18点4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定

杂交瘤细胞鉴定：染色体分析。它是鉴定的客观指标，了解分泌抗体的能力。

单抗进行Ig类和亚类鉴定：用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴定。亲和力、特异性、纯度、分子量测定。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第24页\共有52页\编于星期六\18点杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定—染色体分析正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为62~68，NS-1为54~64，大多数为非整倍性，有中部和亚中部着丝点。杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反之，则反。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第25页\共有52页\编于星期六\18点5、

McAb的大量制备体外培养法可获的10μg/ml抗体体内诱生法可获的5～20mg/ml抗体抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第26页\共有52页\编于星期六\18点6、McAb的纯化依单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。体内诱生法单克隆抗体的纯化方法：（1）澄清和沉淀处理：1000g离心5min，去除沉淀物（红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块和脂质）——20000g高速离心30min,去除残留的小颗粒物质——用0.2µm微孔滤膜过滤，去除细菌、支原体——饱和硫酸铵沉淀抗体（50%饱和硫酸铵能回收90%以上的抗体）。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第27页\共有52页\编于星期六\18点（2）分离A、凝胶过滤：用于IgG和IgM类。常用SephadexG200作为分离介质，可收集到3个峰，最高峰为IgM，另外两个峰为IgG。抗体回收率达50~80%，能去除污染的微量杂蛋白，抗体纯度可达95%以上。B、阴粒子交换层析：用于IgG类的分离纯化。在pH7.4条件下，IgG1和IgG2能结合在DEAE填料上，其中IgG2a可在较低粒子强度下洗脱下来，其纯度很高。IgG2b和IgG3在低粒子强度下易发生沉淀，可增加粒子强度以提高产量，但其纯度相对较低。

C、亲和层析：多用蛋白A亲和层析。适用于IgG类。IgG类与蛋白A的结合与pH有密切的关系。鼠源性单抗在pH8.0时，IgG2b、IgG3几乎全部结合在蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5缓冲液可洗脱下IgG2b，pH4.0缓冲液可洗脱下IgG3，pH4.5缓冲液可洗脱下IgG2a，pH6.0可洗脱下IgG1。用蛋白A亲和层析收获的抗体纯度和很高，但也有极微量的杂蛋白。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第28页\共有52页\编于星期六\18点癌细胞可培养生长浆细胞Bcell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组染色体混在一起也可以培养生長产生专一性抗体一个

Bcell只产生一种抗体抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第29页\共有52页\编于星期六\18点

●

一个B细胞只能生产一种抗体，对付某一抗原决定基●若有许多抗原决定基，则需许多株B细胞分别生产许多抗体BBBYYYY抗原BYB亲和力成熟11Y22Y33Y44抗原决定基抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第30页\共有52页\编于星期六\18点1234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾细胞+癌细胞各抗体分开Turn20抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第31页\共有52页\编于星期六\18点

抗体-a-b-c-d-a-b-c-d抗原决定基BALB/cabbcd传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和

脾脏产生各种B细胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫

抗原采血后可得传统抗血清已建立之小鼠骨髓癌细胞株由脾脏收集B细胞抗原通常有多个抗原决定基免疫后的脾脏约在两月内注射五到八次AgX抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第32页\共有52页\编于星期六\18点-d细胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤细胞（Subcloning）

(确定只有一种细胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌细胞Bcell脾细胞分株培养筛选筛选单抗传统抗体(抗血清)试验专一性对抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d’新的抗原抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第33页\共有52页\编于星期六\18点第三节基因工程抗体

GeneticEngineeringAntibodyMcAb具有高度特异性、均一性、又有来源稳定可大量生产等特点，促进了基础医学和临床医学等众多学科的发展。存在的缺陷，McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内有排斥反应；完整抗体分子的相对分子量过大，难以穿透肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。降低McAb的免疫原性；降低McAb的相对分子量。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第34页\共有52页\编于星期六\18点抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第35页\共有52页\编于星期六\18点抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第36页\共有52页\编于星期六\18点抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第37页\共有52页\编于星期六\18点对鼠源性的McAb进行基因加工和改造目的：降低免疫源性；降低相对分子量方式：一、人-鼠嵌合抗体二、改形抗体三、Fab与Fv抗体四、scFv五、单域抗体和分子识别单位抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第38页\共有52页\编于星期六\18点一、人-鼠嵌合抗体ChimericAntibodies人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第39页\共有52页\编于星期六\18点构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。构建重组表达载体抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第40页\共有52页\编于星期六\18点克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第41页\共有52页\编于星期六\18点二、改形抗体ReshapingAb（CDR移植抗体）CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改形抗体，也就是人源化抗体。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第42页\共有52页\编于星期六\18点经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体）抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第43页\共有52页\编于星期六\18点人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第44页\共有52页\编于星期六\18点定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第45页\共有52页\编于星期六\18点最小识别单位单域抗体FabFvScFvFab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等都是小分子抗体小分子抗体抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第46页\共有52页\编于星期六\18点三、Fabfragmentofantigenbinding重链VH加CH1和完整的轻链组成,大小为完整分子的1/3把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。抗体制药BiotechnologicalPharmaceutics当前第47页\共有52页\编于星期六\18点四、Fv及ScFvFv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。