高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定卡铂和氯铂酸的含量

高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定卡铂和氯铂酸的含量李冰茹;刘静;姚真真;王北洪;李强;付伟丽;马智宏【摘要】称取样品0.1000g,用水溶解后，根据被测物浓度不同加水定量稀释至合适浓度.在高效液相色谱分离中，选择PRP-X100为分离柱,由于固定相上键合有二乙烯基苯/三乙胺聚合物，对氯铂酸和卡铂的分离效果较好.用60mmol-L-1硝酸铵溶液(预先用稀氨水或稀硝酸调节其酸度至pH5.5)为流动相，按等梯度程序进行洗脱.分离后的洗脱液按质谱仪器的工作条件进行测定结果表明:氯铂酸和卡铂的线性范围依次为1.00~100|jg・L-1和500.0~1000|jg・L-1;检出限(3S/N)依次为0.1,0.0却g・L-1.按标准加入法在实际样品基础上进行回收试验，测得氯铂酸的回收率为90.0%~98.8%,卡铂的回收率为98.5%~99.2%,两者测定值的相对标准偏差(n=6)依次为2.7%~3.4%和2.1%~2.8%.应用上述方法进行实际样品分析时还发现，当卡铂的检测量为1mg-L-1时未检测到氯铂酸，故该方法无需富集就能达到痕量铂的测定.【期刊名称】《理化检验-化学分册》【年(卷)，期】2019(055)007【总页数】4页(P865-868)【关键词】高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法;卡铂;氯铂酸;制剂【作者】李冰茹;刘静;姚真真;王北洪;李强;付伟丽;马智宏【作者单位】北京农业质量标准与检测技术研究中心农业部农产品质量安全风险评估实验室，北京100097;北京农业质量标准与检测技术研究中心农业部农产品质量安全风险评估实验室，北京100097;北京农业质量标准与检测技术研究中心农业部农产品质量安全风险评估实验室，北京100097;北京农业质量标准与检测技术研究中心农业部农产品质量安全风险评估实验室，北京100097;北京农业质量标准与检测技术研究中心农业部农产品质量安全风险评估实验室，北京100097;北京农业质量标准与检测技术研究中心农业部农产品质量安全风险评估实验室，北京100097;北京农业质量标准与检测技术研究中心农业部农产品质量安全风险评估实验室，北京100097【正文语种】中文【中图分类】O657.63卡铂为第二代铂类抗癌药物，在卡铂合成过程中存在原料物质氯铂酸，其中，卡铂（分子式为C6H12N2O4Pt）对癌症治疗是有效的，而氯铂酸（分子式为H2PtCl6・6H2O）对人体是有害的。因此，在快速测定卡铂含量的同时，需要能够快速测定氯铂酸的含量，为科学评价卡铂的用药安全提供参考依据。目前，《中国药典》（ChP2015）、《日本药典》（JP17）、《美国药典》（USP39）和《欧洲药典》（EP8.0）均收载了卡铂药物杂质检查的情况［1］。各国药典对相同杂质的分析方法与规定限量值大多相似，有机杂质的分析方法以高效液相色谱法（HPLC）为主。对于卡铂，药典中设立的杂质物质主要为相关物质、1,1-环丁烷二羧酸、银以及顺铂，但是对于制剂中存在的具体物质，例如氯铂酸的检测并未明确给出分析方法和技术条件。对卡铂含量的测定更关注于临床意义中的血液和尿液中卡铂含量的检测［2-5］。对于卡铂中杂质的研究较少，谌喜珠等［6］采用薄层色谱法分离卡铂及其杂质二碘二氨合铂（H）和1,1-环丁烷二羧酸银，VIVEKANANDA等［7］建立了液相色谱-串联质谱法检测卡铂注射液中的降解产物。因此，寻找一种高灵敏度的检测方法，开展卡铂及其制剂中不同形态铂的痕量检测方法具有十分重要的意义。杨叶梅等［8］研究了电感耦合等离子体原子发射光谱法测定卡铂血药浓度的分析方法；张萍等［9］提出了反相高效液相色谱法测定卡铂制剂中卡铂含量的分析方法。相对而言，高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）测定卡铂含量的方法得到了广泛的认可和应用［10-14］。HPLC-ICP-MS具有灵敏度高和线性范围较宽等优点，适应于同时对不同级别含量的卡铂和氯铂酸进行测定。1试验部分1.1仪器与试剂Flexar型高效液相色谱仪；NEXION350型电感耦合等离子体质谱仪；VORTEX4BASIC型涡旋混合器；XS250型分析天平；KQ-500DE型超声波清洗机；VORTEX-6型涡旋混合器；827型pH计。氯铂酸标准储备溶液：1000mg・L-1，称取氯铂酸2.1026g，用水溶解并转移至1L容量瓶中，用水定容，混合摇匀。现用时逐级稀释。卡铂标准储备溶液：1000mg・L-1，称取卡铂1.1008g，用水溶解并转移至1L容量瓶中，用水定容，混合摇匀。现用现配。混合标准溶液系列：分别移取各适量的氯铂酸标准储备溶液和卡铂标准储备溶液，用流动相稀释配制成质量浓度依次为2.5,5.0,7.5,10.0,12.5凹・L-1的混合标准溶液系列。卡铂标准品（纯度不小于98%）和氯铂酸标准品（纯度为99.9%）均为分析纯；甲醇为色谱纯；硝酸和氨水为优级纯；试验用水为超纯水。1.2仪器工作条件1）色谱条件HamiltionPRP-X100阴离子色谱柱（250mmx4.6mm,10pm）;柱温为室温；流动相为pH为5.5［用10%（体积分数，下同）氨水溶液或2%（体积分数，下同）硝酸溶液调节］的60mmol・L-1硝酸铵溶液；等梯度洗脱；流量为1.2mL-min-1;进样量为100"。2）质谱条件射频功率为1550W;等离子气流量18.0mL・min-1，辅助气（氩气）流量1.2mL-min-1，雾化气（氩气）流量1.14mL-min-1;采用碰撞池反应模式，反应气体为氦气；测量质量数为195Pt。1.3试验方法称取0.1000g样品，用适量的水充分溶解，根据浓度不同进行稀释，然后经过0.45pm水相系微孔滤膜过滤，按照仪器工作条件进行测定。2结果与讨论2.1色谱行为按照仪器工作条件对5pg・L-1的氯铂酸和1mg・L-1的卡铂的混合标准溶液进行测定，色谱图见图1。图1混合标准溶液的色谱图Fig.1Chromatogramofthemixedstandardsolution2.2色谱柱的选择液相色谱中常用的RP-C18色谱柱和反相C18色谱柱对氯铂酸和卡铂的分离效果不好，保留性差。在文献［15-16］的基础上，试验选择了AS19色谱柱和PRP-X100离子交换柱，其固定相上键合有二乙烯基苯/三乙胺聚合物，具有C18色谱柱的反相保留能力和阴离子交换能力，对氯铂酸和卡铂的分离效果较好，考虑到AS19色谱柱柱长较长，分离时间较长。试验选择的色谱柱为PRP-X100短柱，可以在较短时间内完成氯铂酸和卡铂的分离。2.3流动相的选择试验考察了分别以50mmol-L-1磷酸二氢铵溶液（用10%氨水溶液调节pH至6.0）、甲醇（90+10）溶液和60mmol・L-1硝酸铵溶液（用10%氨水溶液或2%的HNO3溶液调节pH至5.5）为流动相时，对氯铂酸和卡铂的分离效果的影响。结果表明：以甲醇（90+10）溶液、磷酸二氢铵溶液和硝酸铵溶液为流动相时，均可以实现氯铂酸和卡铂的分离，考虑到磷酸二氢铵溶液黏度较大，容易造成色谱柱堵塞，而甲醇（90+10）溶液中因存在有机溶剂，易造成锥孔积碳，试验选择以硝酸铵溶液为流动相。试验进一步发现，当硝酸铵溶液的浓度大于60mmol-L-1时，氯铂酸和卡铂的色谱峰会发生重叠，无法实现基线分离。综合考虑，试验选择浓度为60mmol・L-1的硝酸铵溶液（用10%氨水溶液或2%的HNO3溶液调节pH至5.5）为流动相。2.4标准曲线和检出限按照试验方法对混合标准溶液系列进行测定，以氯铂酸和卡铂的质量浓度为横坐标，与其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，氯铂酸和卡铂的线性范围、线性回归方程以及相关系数见表1。以3倍的信噪比计算方法的检出限（3S/N），结果见表1。表1线性参数和检出限Tab.1Linearityparametersanddetectionlimits化合物线性范围p/（pg-L-1）线性回归方程相关系数检出限p/（pg-L-1）氯铂酸1.00~100y=2.192x103x+4.493x1020.99950.1卡铂500.0~1000y=1.570x104x+1.137x1050.99970.012.5精密度和回收试验按照标准加入法对实际样品进行加标回收试验，平行测定6次，计算回收率和测定值的相对标准偏差（RSD），结果见表2。表2精密度和回收试验结果（n=6）Tab.2Resultsoftestsforprecisionandrecovery（n=6）化合物本底值p/（pg-L-1）加标量p/（pg-L-1）测定总Bp/Cpg-L-l)回收率/%RSD/%氯铂酸-5.04.590.03.420.019.549.498.82.7卡铂254.320.0274.098.52.8100.0353.399.02.3200.0452.7实际样品分析按照试验方法对实际样品进行测定，结果发现：当卡铂的测定质量浓度为1mg-L-1时，未有氯铂酸检出，可见该方法无需富集就能满足痕量杂质的测定。本工作建立了一种采用HPLC-ICP-MS测定卡铂及其制剂残留的分析方法，该方法具有操作简单、快速、灵敏性高、线性范围宽等优点，为卡铂制剂中痕量的杂质分析提供了可靠的方法。参考文献：【相关文献】[1]还传静，李悦，陆静.铂类药物杂质及其检测方法的研究进展[J].中国药房，2017,28(30):4315-4320.[2]陈嘉彬，何蔓，陈贝贝，等.磁固相萃取与高效液相色谱-等离子体质谱联用检测癌症病人尿样中的卡铂药物[J].分析科学学报，2014(5):607-612.[3]黄品芳，刘亦伟，王长连.高效液相色谱法测定人血清卡铂浓度[J]福建医科大学学报，2007,41(4):363-364.[4]谢志红，叶丽卡，周龙书，等.高效液相色谱法测定人血浆中卡铂浓度[J].中国医院药学杂志，2009,29(6):457-459.[5]刘德晔，朱醇，马永建，等.高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱测定血浆中铂类抗癌药物[J].分析试验室，2012,31(7):75-79.[6]谌喜珠，杨一昆，熊惠周，等.抗癌药物卡铂薄层色谱分析方法研究[J].贵金属，1999,20(2):40-42.[7]VIVEKANANDANK,SWAMYM,PRASADS,etal.Identificationofdegradationproductsfromaqueouscarboplatininjectionsamplesbyelectrospraymassspectrometry[J].InternationalJournalofPharmaceutics,2006,313(1/2):214-221.[8]杨叶梅，贺与平，陈金素，等.ICP-AES法测定顺铂、卡铂血药浓度[J].中国卫生检验杂志,2000,10(3):259-261.张萍，杨慧，宋梅，等.RP-HPLC法测定卡铂制剂中卡铂的含量[J].中国药房，2012,23(4):367-369.马张英，李文钧，裘飞君，等.高效液相色谱法测定卡铂粉针和水针剂的含量[J].中国医院药学杂志，2004,24(4):247-248.[11]FERNNDEZ-PERALBOMA,PRIEGO-CAPOTEF,LUQUEDCD,etal.LC-MS/MSquantitativeanalysisofpaclitaxelanditsmajormetabolitesinserum,plasmaandtissuefromwomenwithovariancancerafterintraperitonealchemotherapy[J].JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,2014,91:131-137.[12]杜春双，陈琛，宋晓坤，等.卡铂注射液的含量测定及其临床使用稳定性研究[J].中国药房,2011,22(5):442-444.[13]SHUC,ZENGTM,GAOSH,etal.LC-MS/MSmethod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