实验十一淋巴细胞玫瑰花结实验

实验十一淋巴细胞玫瑰花结实验第一页，共十七页，编辑于2023年，星期二一、实验目的1.掌握人淋巴细胞的制备原理和方法及绵羊红细胞悬液的制备。2.掌握淋巴细胞玫瑰花结制备方法并了解该技术在实际工作中的用途。第二页，共十七页，编辑于2023年，星期二人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体,在体外一定条件下将人淋巴细胞与绵羊红细胞两者混合,可以形成以T细胞为中心,周围黏附着多个绵羊红细胞的花环,为E花环试验(erythrocyterosettetest)。应用最广的有总E花环试验(Et,t为total的缩写)和活性E花环试验(Ea,a为active的缩写)。Et代表被检标本中T淋巴细胞的总数,Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T细胞数,这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化。E花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能。广泛应用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究,为某些疾病诊断和防治提供免疫学方面的重要参考。二、实验原理第三页，共十七页，编辑于2023年，星期二E玫瑰花环实验→判断细胞免疫功能TBTT淋巴细胞玫瑰花结电镜照片T淋巴细胞玫瑰花结示意图第四页，共十七页，编辑于2023年，星期二三、实验仪器、材料和试剂1、材料无菌抽取的人静脉血,加入事先有适量肝素液的试管内,混匀抗凝。健康绵羊红细胞小牛血清（经56℃30min灭活）。按10：1加入洗过的压积兔红细胞，混匀。于37℃吸收30min，4℃冰箱过夜。然后以2000r/min离心10min。取上清液经蔡氏滤器过滤后，无菌条件下分装于小瓶。低温保存。第五页，共十七页，编辑于2023年，星期二三、实验仪器、材料和试剂2、试剂抗凝剂：1%的肝素钠生理盐水溶液。0.90%的生理盐水。Alsver‘s溶液。Hank溶液。细胞分层液：上海试剂二厂产品。0.8%戊二醛溶液：使用前15min用生理盐水或Hank液配制。染色液：瑞氏或Giemsa染液。1%醋酸溶液。第六页，共十七页，编辑于2023年，星期二三、实验仪器、材料和试剂3、仪器光学显微镜、离心机、水浴锅、血细胞计数板、50UL微量加样器、医用剪刀及眼科镊子、蔡氏滤器、刻度离心管（10ml）、滴管及吸管、载玻片和盖玻片。第七页，共十七页，编辑于2023年，星期二四、方法与步骤1.绵羊红细胞悬液的制备依无菌手续从从绵羊颈静脉取血，放置4倍体积的Alsver’s液中，摇匀（放置4℃冰箱保存，限7～10天内用）。临用前用Hank液洗涤3次，每次1000r，离心5min。取压积的绵羊红细胞用Hank液配成1%的细胞悬液（约2×107个/ml）第八页，共十七页，编辑于2023年，星期二四、方法与步骤洗涤后悬浮的红血球红血球在血球计数板上的密度第九页，共十七页，编辑于2023年，星期二密度梯度离心分离纯化淋巴细胞示意图四、方法与步骤2.淋巴细胞的分离和制备取1支洁净、干燥的离心管加入人抗凝血1ml，再加入1mlHanks液稀释血液；取1支洁净、干燥的离心管，加入1ml细胞分层液；用吸管吸取上述稀释血液，沿离心管管壁加于细胞分层液的表面（不能冲乱液面）。以3000r/min离心20min，可出现分层，详见图。

第十页，共十七页，编辑于2023年，星期二经离心分离纯化后的血浆和分层液之间的灰白色淋巴细胞照片第十一页，共十七页，编辑于2023年，星期二四、方法与步骤用吸管将血浆和分层液之间的乳白色淋巴细胞层吸至含1.5mlHank液的离心管中，混合后后2000r/min离心5min。弃上清，沉淀用Hank液重复洗一次，于沉积细胞中加0.5mlHank液混匀,取20ul淋巴细胞悬液，加0.78ml1%的醋酸混匀，将淋巴细胞配成5x106个/ml。第十二页，共十七页，编辑于2023年，星期二3.反应：取淋巴细胞悬液（5×106个/ml）0.1ml；加入灭活吸收的小牛血清0.1ml，再加入2×107个/ml绵羊红细胞悬液0.2ml混匀；使淋巴细胞与绵羊红细胞的比例分别为1：8（活性玫瑰花结）。置37℃孵育5min，其间轻轻摇动2~3次。取出离心管，以500r/min离心5min，将离心管置40冰箱放置5min。取出后轻轻旋转混匀（切不可甩动试管，以免花环脱落）。沿管壁加入0.8%戊二醛溶液3滴，再轻旋转混匀。置4℃，5min。自冰箱取出后，以500r/min离心5min，弃上清，沉淀混匀制片。四、方法与步骤第十三页，共十七页，编辑于2023年，星期二4、制片取1滴标本悬液滴于载玻片上（载玻片事先浸在蒸馏水中置4℃冰箱），使悬液自然均匀铺开，待自然干燥或微风吹干后，用瑞氏染液染色5~10min。用自来水冲去染液，待干燥后镜检计数。5、计数方法在高倍镜或油镜下数200个淋巴细胞，每个淋巴细胞结合3个以上的绵羊红细胞为玫瑰花结形成细胞。形成玫瑰花结的淋巴细胞数目以百分率表示。四、方法与步骤第十四页，共十七页，编辑于2023年，星期二五、实验结果T淋巴细胞玫瑰花结光镜照片第十五页，共十七页，编辑于2023年，星期二1.一定要用新鲜血，否则会影响细胞活性，且红细胞受体会从T细胞表面脱落。2.计数前，重悬和混匀细胞要轻柔，否则花结会散开消失。六.注意事项第十六页，共十七页，编辑于2023年，星期二七.