C18色谱柱的选用、保养与维修

C18⾊谱柱的选⽤、保养与维修据统计，近80%的有机物及⽆机物可以⽤⾼效液相⾊谱法进⾏分离，其中反相⾊谱中的C18⾊谱柱是⾼效液相⾊谱中最为常⽤的⼀类⾊谱柱。下⾯就C18⾊谱柱的选⽤、保养与维修作⼀介绍。选⽤C18的选⽤主要考虑2个问题，即柱填料和柱规格对⾊谱柱的影响。1.1C18柱的填料对⾊谱柱的影响柱填料的物理性能对填料⾊谱⾏为有重要影响。填料主要的物理性能包括如下：颗粒度、孔径、孔体积、键合相化学、含碳量及烷基化处理。(1)颗粒度是指柱填料的颗粒直径的⼤⼩。实际上⾊谱柱上所标的粒径是⼀个平均值。如粒径“5µm”并不是柱中填料所有的颗粒直径都是5µm，实际上有⼀个颗粒分布度。这种分布度对柱反压及柱效有重要作⽤。⼀般来说，平均颗粒度越⼩，颗粒分布度越⼩，⾊谱柱效越⾼，反压亦越⾼。⽬前C18柱填料粒径在4～10µm之间。(2)孔径是指填料颗粒间的孔间隙。⼀般所说的孔径是指填料的平均孔径。球形填料装柱后平均孔径分布⽐较窄，柱床结构均匀，柱效⾼，重现性好；⽆定形填料平均孔径分布较宽，柱床结构不均匀，流动相线性速度不均匀，谱带扩宽。平均孔径的⼤⼩对分离⼤分⼦化合物有较⼤的影响，在分离含有较⼤分⼦的样品时可能会有分⼦排阻效应，或产⽣吸附效应从⽽影响定量的回收率及准确度。因⽽在⽤反相⾊谱分离诸如蛋⽩或多肽样品时应考虑选⽤⼤孔径(如30nm)的反相柱填料。孔体积作为硅胶多孔性的参数，在分离分析较⼤分⼦化合物时可作参考，选⽤较⼤孔体积的反相柱填料。(3)化学键合相填料在⾼效液相⾊谱法中占有极重要的地位。它可以键合极性较⼤的有机基团，采⽤极性较⼩的溶剂作流动相。亦可键合极性较⼩的有机基团，选⽤极性较⼤的溶剂作流动相。C18⾊谱柱是以硅烷化键合型(Si-O-Si-C)存在的，这类键合反应⽬前应⽤最为普遍。如以⼗⼋烷基三氯硅烷与全多孔型硅胶M-Porasil-C18反应⽣成烷基化学键合相，商品名为M-Bondapak-C18(4)碳含量即填料中的含碳量。传统的测量技术是将填料加热到碳氢键断裂，然后通过测定损失的重量或形成的⼆氧化碳来计算碳含量。可以通过增加碳键的长度或增加键合密度来增加碳含量。碳含量增加，柱⼦的保留值增加。键合相的⾊谱⾏为与键合密度有关，也与硅胶的密度及填料的表⾯积有关，填料的密度越⾼，填柱所需的硅胶量越多，柱⼦的含碳量也越⾼。如果⽤2种不同密度相同碳含量的填料填充柱⼦，其保留⾏为将明显不同。因此，单独以碳含量来预测⾊谱⾏为是不够的。(5)C18硅烷化试剂是⼀个⼤于2nm⼤分⼦，因此会与已键合在相邻的硅醇基上的C18硅烷化试剂产⽣严重的⽴体位阻。其结果导致在硅胶表⾯有⼤量的残留硅醇基没有与硅烷化试剂反应，这些极性的硅醇基在⼀定⾊谱条件下会与碱性化合物相互作⽤引起峰形拖尾，从⽽可影响定量分析结果。这些问题在⼀定程度上可以通过烷基化处理加以克服。烷基化处理是在键合相上完成的独⽴反应，以减少在硅胶表⾯的硅醇基。烷基化处理采⽤⼩分⼦(如三甲硅烷)的试剂，其空间位阻远⼩于C18基团。⼤多数固定相仅有30%可覆盖的键合位置。据报道，通过某些极活跃的化学试剂及特殊的反应条件，最⾼的覆盖量可达50%。很好地了解硅胶键合相的物理特性将有助于在⾼效液相⾊谱的反应中选择合适的⾊谱柱。表⾯上看C18柱虽然化学官能团相同，⽽实际上不同品牌的C18柱性能可能有很⼤差别，从⽽产⽣不同的分离结果。1.2C18柱的规格对⾊谱柱的影响柱填料的选择关系到⾊谱分离的可能性，⽽柱规格的选择直接影响分析速度、分离能⼒、检测能⼒及每次分析的溶剂消耗等。柱规格包括两⽅⾯：柱内径和柱长度。柱内径，分析型⼀般为2～6mm,制备型20mm，⼤者可达80mm；柱长度，分析型5～30cm，制备型15～50cm。⼀般来说，柱内径不影响分离度与分析时间的关系。今天，柱技术已发展到不同柱内径的柱⼦能够具有相同的性能。不同内径的柱⼦⼜各具特点，对相同的分析时间和分离度来说，内径⼤的柱⼦⽐内径⼩的柱⼦多消耗溶剂。另⼀⽅⾯，较⼩内径的柱⼦对相同的检测信号来说所需样品量亦较少。因此，在样品量有限时，可使⽤⼩内径柱。柱长度增加虽可改善分离效果，但阻⼒也随之增加，必须提⾼⼊⼝压⼒。柱压是同时影响增加分离度和减少分析时间的主要障碍。分离度、分析时间及柱压三者相互制约，选择好其中两者，则第3个因素也就选好了。长柱可以给出⾼分离度，短柱可提供快速分离，我们可以根据样品情况去选⽤合适的⾊谱柱1.3C18柱选⽤的基本原则(1)选⽤经过烷基化处理封⼝的填料可防⽌碱性化合物的拖尾现象。

(2)选⽤含碳量⾼的柱⼦，增加保留值。(3)选⽤较短的柱⼦(如15cm，7.5cm)。(4)选⽤⼩颗粒度的填料。(5)对分⼦量⼤的组分选⽤⼤孔径填料的柱⼦。⽇常使⽤和维护在⽇常分离分析⼯作中，⾊谱柱使⽤是否得当，直接影响⾊谱柱的寿命。下⾯介绍C18柱在⽇常使⽤过程中应注意的事项。2.1柱⼦在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要适度。必须防⽌较强的机械振动，以免柱床产⽣空隙。2.2如果仪器⽤来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每⼀类常规分析配置1根专⽤柱，这样有助于延长柱⼦的寿命。2.3如使⽤柱温控制装置时，应注意在⼊流动相后才能升温。2.4流动相使⽤前需进⾏脱⽓处理，以免降低柱效和影响检测等。样品溶液需经适当的前处理及过滤，以减少柱污染和堵塞。2.5在更换流动相种类时，应注意溶剂的互溶性，防⽌发⽣盐析现象。2.6柱⼦的实际操作压⼒应低于填装时的最⾼压⼒，最好在最⾼压⼒⼀半以下。⼀般不超过20593.965～29419.95kPa。在低压⼒(≤14709.975kPa)的范围使⽤，可使柱保持长时期的⾼柱效。2.7C18⾊谱柱属⾮极性键合相⾊谱柱，流动相的pH值应严格2～7之间，以免损坏柱⼦。2.8在完成分离分析⼯作之后，不应⽴即停机，需及时对⾊谱分析系统进⾏冲洗，⼀般0.5h以上，以除去⾊谱柱内的杂质。2.9如果流动相中有盐类，⾸先⽤⽔充分清洗。如果是胺类(如三甲胺类或四丁基胺类)添加到流动相中，要⽤50%甲醇和0.05%磷酸溶液混合溶剂冲洗，不要只⽤⽔冲洗。2.10C18⼀般⽤100%甲醇作为保存溶剂，以防柱⼦⼲裂⽽损坏。严禁⽔或缓冲溶液长时间在⾊谱流路中保留。2.11选⽤合适的C18保护柱，以保护分析柱免受杂质颗粒及不可逆吸附的⼲扰物的影响。保护柱内装填料颗粒度应与分析柱填料的颗粒度尽量⼀致。2.12柱的保存期不宜太长。短期不⽤的C18柱，⽤甲醇冲洗30～60min，然后将柱两端密封。较长期不⽤的柱⼦，⼀是采取定期冲洗，再密封的⽅法；⼆是在冲洗后，柱两端各装1只有⼀定容量的灌满甲醇的容器(只装⼀端也可)，以补充在较长存放期间柱内溶剂的蒸发。维修⾊谱柱在⽇常使⽤过程中，尽管保护严格，样品和流动相尽管经过前处理，但经过长时间的使⽤，仍然难以完全避免柱⼦受到污染，固定相流失、板结、柱床塌陷以及柱效下降等。有些可以通过维修，使部分柱效恢复。3.1柱污染再⽣技术⾊谱柱污染后，可以⽤合适的溶剂冲洗，使柱效再⽣。C18柱常规的再⽣洗涤⽅法是：分别⽤甲醇、三氯甲烷、甲醇/⽔各60mL依次通过⾊谱柱，再⽤100%甲醇60mL平衡⾊谱柱后封存，柱效将恢复正常。必要时，根据柱污染性质(如有机污染、盐类污染等)，采⽤0.05mol/LH2SO4、0.5mol/LH3PO4或0.1mol/LEDTA钠盐冲洗，然后再⽤⽔冲洗，最后

机污染、盐类污染等)，采⽤0.05mol/LH2SO4、0.5mol/LH3PO4或0.1mol/LEDTA钠盐冲洗，然后再⽤⽔冲洗，最后⽤100%甲醇平衡⾊谱柱后封存。对于严重污染的C18柱，可采⽤⽔、甲醇、氯仿、⼄烷依次冲洗后，按顺序倒过来再冲洗1次，每次所⽤溶剂60mL，不接检测器，最后⽤100%甲醇平衡⾊谱柱封存。3.2柱污染的修复在柱污染再⽣⽆效或已知柱污染严重时，可以采⽤柱修补的⽅法解决，但柱污染深度不宜超过5mm。⽅法是将特制⼩铲将污染部分挖去，再⽤与柱填料相同的固定相与流动相混合制成浆状，然后将浆状固定相仔细补⼊被挖去的部分(尽量使后