实验三蛋白质的性质实验

实验三蛋白质的性质实验第一页，共十三页，编辑于2023年，星期二实验目的1.加深了解构成蛋白质的基本结构单位（氨基酸）和主要连接方式（肽键）2.了解呈色反应原理3.学习几种常用的鉴别蛋白质和氨基酸的方法第二页，共十三页，编辑于2023年，星期二#双缩脲反应1）原理：将尿素加热到180℃，则两分子尿素缩合而成一分子双缩脲，并放出一分子氨。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。（蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产生的颜色在540nm处比色，定量测定蛋白质）。第三页，共十三页，编辑于2023年，星期二#双缩脲反应2）试剂：（1）尿素（2）10%氢氧化钠溶液（3）1%硫酸铜溶液（4）2%卵清蛋白溶液

2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水=1：9）第四页，共十三页，编辑于2023年，星期二#双缩脲反应3）操作：取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化，然后停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化化钠溶液10滴，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。向另一试管加卵清蛋白溶液约5滴和10%氢氧化钠溶液约10滴，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。第五页，共十三页，编辑于2023年，星期二#双缩脲反应4）注意事项：含有一个肽键和一个-CS-NH2,-CH2-NH2，-CRH-NH2等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。第六页，共十三页，编辑于2023年，星期二#茚三酮反应1）原理：在加热条件下，所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。此反应十分灵敏，根据反应所生成的蓝紫色的深浅，进行比色就可测定样品中氨基酸的含量，也可以在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或定量分析。第七页，共十三页，编辑于2023年，星期二#茚三酮反应2）试剂：（1）2%卵清蛋白（2）0.5%甘氨酸溶液（3）0.1%茚三酮-乙醇溶液第八页，共十三页，编辑于2023年，星期二#茚三酮反应3）操作：（1）取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液5滴，再各加2滴0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1-2分钟，观察颜色由粉色变紫色再变蓝。（2）在一小块滤纸上滴一滴0.5%缬氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。第九页，共十三页，编辑于2023年，星期二#茚三酮反应4）注意事项：

β―丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。此反应的适宜pH为5-7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。第十页，共十三页，编辑于2023年，星期二#考马斯亮蓝反应1）原理：考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。在0.01-1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。第十一页，共十三页，编辑于2023年，星期二#考马斯亮蓝反应2）试剂：

（1）2%卵清蛋白（2）考马斯亮蓝染液第十二页，共十三页，编辑于2023年，星期二