核医学第4章放射性核素标记化合物课件

第四章放射性核素标记化合物

RadionuclideLabeledCompounds2014-2-281示踪技术

观察野生动物大熊猫的生活习性无线电发射器

示踪物

放射性核素酶荧光素

21923年,G.Hevesy首次通过测定放射性铅的射线来观察其在动、植物体内的分布；1952年Hershey32P、35S→DNA是遗传物质；1959年Berson、Yalow→RIA；1958年

Meselson、Stahl→DNA半保留复制；1977年，FrederickSanger等采用放射性标记技术和ARG，成功地进行了DNA序列测定。示踪实验之父32P、131I、14C、3H先后被用于医学实验研究RNA-DNA逆转录、遗传的三联密码、细胞周期、微量物质测量等均离不开示踪技术。History3如何用噬菌体感染实验证明DNA是遗传信息的载体？Introduction4如何用噬菌体感染实验证明DNA是遗传信息的载体？5如何用噬菌体感染实验证明DNA是遗传信息的载体？35S32P35S32P子代分离蛋白质外壳及DNA内核，并测量放射性蛋白质外壳无放射性，DNA上有放射性！DNA是遗传物质！6为什么要用放射性核素作为示踪剂？

一般非放射性物质进入机体后无法区别哪些是外来的？哪些是原有的物质？有些物质进入机体后发生代谢转化、分解，无法再找到它的踪迹。Tracer7核医学应用

8PETandSPECT:AdvancedImagingSystemsPositronEmissionTomographySingle-PhotonEmissionComputedTomographyAPETscancanbeaneffectivetooltodiagnoseParkinson’sdisease9Radiopharmaceutical

RadiotherapyPrincipleDefinition放射性核素标记化合物：它是指在化合物分子中引入可起示踪作用的放射性核素，并保持原有化合物的理化和生物学性质不变的一类化合物。

11本章内容第一节基本概念13一、几个重要参数1.放射性浓度：它是指单位体积的溶液中含有的放射性活度。以Bq/L或Bq/ml等表示。2.放射化学纯度：指所指定的放射性标记化合物的放射性活度占该样品的总放射性活度的百分比。要求放化纯度要达到95%以上放化纯度(%)=(标记物的放射性活度)/(样品总的放射性活度)×100%放射性示踪实验是以测量放射性的踪迹来显示该物质的行踪的，如果示踪剂中含有放射数杂质，就会使实验结果紊乱，甚至失败。放射性杂质不仅可以从原料及制备过程中引入，而且也会随着标记物贮存时间的延长而逐渐产生。因此不仅制备标记化合物时得要进行纯化分离，而且在贮存过程中仍要密切监测它的放射化学纯度，特别是高比活度的氚标记化合物。143.放射性比活度对比活度的要求因使用目的而异：一般用于竞争结合分析法测定微量物质时要求比活度高，以提高分析方法的灵敏度。作为示踪剂用于观察某些物质的体内过程时，则要求尽量接近生理状态下的用量而同时具有可测量的放射性活度。过高或过低均不好：放射线比活度越高，示踪的灵敏度也越高，但制备和使用高比活度标记物，有如下因素的限制：一是受原料比活度和制备方法的限制；二是比活度愈高，制备操作难度愈大；三是比活度高时，特别是氚标记物，易引起辐射自分解，还会对被示踪的机体产生毒性(如研究对象的细胞损伤和蛋白变性)，影响实验结果。过低的比活度因其灵敏度过低而达不到预期的实验目的。单位质量（摩尔、容积）物质所含放射性的多少，后者常称为放射性浓度。单位：MBq/mg、GBq/mg、TBq/g或MBq/mmol、GBq/mmol、MBq/ml。153.放射性比活度放射线核素的理论比活度:当该种核素的丰度是100%时其放射性活度。它的大小只取决于核素的半衰期。A理论=λ×N阿伏加德罗常数=0.693/T1/2×6.02×1023标记化合物的放射性比活度:该化合物上的放射线核素活度(Bq)

化合物质量(g)或摩尔数(mol)A=164.化学纯度:指某一化学形式存在的物质量在该样品的总重量中所占的百分比。5.放射性核素纯度：是指特定的放射性核素的放射性活度占总放射性活度的百分数，表示为：放射性核素纯度(%)=(特定的放射性核素的活度)/(样品的总放射性活度)×100%

一般要求放射性核素纯度要达到99%以上。176.标记位置及命名:标记化合物命名，通常先指出标记部位再指出标记核素，最后列出化合物名称，三部分中以二短横线相联，如：1-14C-醋酸。18二、同位素标记与非同位素标记同位素标记：指化合物中的某一稳定核素被其放射性同位素置换的方法。如用3H取代化合物分子中的1H。非同位素标记：采用并非原化合物所含元素的放射性核素(一般选用性质比较接近的放射性核素)进行标记的方法。如蛋白质用131I或125I标记，所得标记物与原来化合物不完全相同。1920三、定位标记与非定位标记定位标记：指标记原子标记在化合物的指定位置上，以符号“S”表示。例如1(S)-14C-醋酸、2(S)-14C-醋酸，前者表示14C标记在醋酸羧基碳上，即CH3-14COOH，后者则标记在甲基碳上，即14CH3-COOH，两者所能示踪的基团不同，制备二者的合成路线也完全不同。21三、定位标记与非定位标记非定位标记：标记原子的结合部位无法确定。分为均匀标记和全标记。均匀标记：指放射性原子均匀地分布于分子中，以“U”表示。如用14CO2通过植物光合作用制得的14C-葡萄糖其中分子六个碳原子从统计学上看被均匀标记上14C，故可写成14C-葡萄糖(U)或u-14C-葡萄糖。全标记：是指放射性核素的原子随机地无严格定位地分布于被标记化合物分子结构上，以“G”表示。如G-3H-胆固醇，标记分子中的所有氢原子都可被取代，但机率各不相同。非定位标记化合物不能用于观察分子上特定基团或原子的去向，而只是代表整个分子的代谢、分布等状况。非定位标记可以得到较高的比活度．因为在一个分子中，可能存在几个标记原子，且制备方法的选用面也较宽准定位标记2223四、双标记与多标记双标记：在化合物分子的不同部位，引入两种不同的放射性核素原子(如3H和14C)或引入一种元素的两种同位素原子。双标使得人们可以在同一机体或离体组织中同时观察两个指标。它们在示踪应用时，可在同一机体或离体组织中同时观察两个指标，不仅减少工作量，还可排除和减少由于个体差异所引起的实验误差．在研究化合物的不同代谢物在代谢中的相互关系、动力学过程以及生物反应机制等问题中，双(多）标记示踪剂能解决一般示踪实验不易解决的问题。24放射性核素标记化合物，除了与相应的非标记化合物具有同样的化学、生物学特性外，更由于分子中引入了放射性原子，增加了不稳定因素：1）放射性衰变引起的不稳定性；2）由放射线引起的辐射自分解；3）由于标记位置不牢固或外界因素的影响，引起放射性原子脱落或定位标记物中放射性原子发生位移等造成不稳定性。一般来说，放射性原子应标记在分子中牢固的、不易脱落的位置，对于14C、35S．13N、32P等放射性核素，标记物位置都比较稳固，而3H在分子中往往不稳定，即使与碳原子相连的氚，由于邻近基团等影响，与水的交换率可以很明显，如苯环上与羧基处于邻位或对位的氚原子及碳基α碳上的氚原子都不稳定。五、标记化合物的不稳定性第二节

放射性核素标记化合物的制备26一、放射性核素的选择不改变原有化合物的理化和生物学性质；结合牢固、稳定性好；有合适的半衰期；射线容易测量；其它：是否容易标记、价格是否可以接受、射线是否容易防护。27二、放射性核素的来源在发现人工核反应前，放射性核素都是从天然放射性铀钍矿物中分离提取，由于品种不多，且特性不适于医用，故应用有限。自从发现人工核反应及加速器和反应堆问世以后，人们才有可能生产许多品种的放射性核素。目前，医用放射性核素主要通过人工核反应，从反应堆和加速器中生产。据统计，全世界所生产的放射性核素中，约有80％一90％用于医学。不论用反应堆还是加速器所生产的放射性核素，都必须经过必要的分离、纯化等放射化学处理，经鉴定放射核纯度合格，并测定比活度后，才能供使用。28二、放射性核素的来源(一)反应堆生产放射性核素1.利用中子引起的核反应：用中子轰击稳定性核素是获取人工放射性核素的来源之一。能量较低的中子，核反应后，俘获中子而放出γ光子，如(n、γ)反应；能量较高的中子，核反应后，释放带电粒子如质子或α粒子等。

23Na+10n(低)→24Na+γ或23Na(n.γ)24Na

6Li+10n(高)→3H+4He或6Li(n、α)3H2.核裂变产物燃料废料中分离提取：核反应堆中所用核燃料235U或239po，在其裂变过程中可产生许多放射性核素，供医用的有：99Mo、131I、132I、133Xe和137Cs等。29二、放射性核素的来源(二)加速器生产利用加速器将质子或氘核等粒子加速后，用其轰击稳定性核素而得到放射性核素。这类放射性核素的衰变方式多为正电子发射或电子俘获。生产医用放射性核素的加速器主要是回旋加速器。生产的11C、15O和13N等放射性核素的T1/2相当短，用处极大。30三、制备放射性标记化合物要考虑的因素放射性核素的获取及其价格：起始原料通常是由反应堆生产的无机物标记物的稳定性：做示踪剂的化合物稳定；标记原子所在的位置也要牢固微量操作技术：一般在毫克或微克级水平进行冷试验：即用非放射线原料代替放射性原料的模拟实验31由人工核反应所制得的放射性核素，一般均为简单比合物，如3H2、Ba14C03、Na125I等。为了得到合适的分析试剂或示综剂，还需进一步以简单放射性化合物为原料，制备所需的放射性标记化合物。制备标记化合物的基本方法有同位素交换法、化学合成法、生物合成法及络合物/螯合物生成法等方法。四、放射性标记化合物制备的基本方法32四、放射性标记化合物制备的基本方法1、同位素交换法放射性核素与要标记的化合物中同一元素的稳定同位素相互交换来制备放射性标记化合物的方法。优点：方法简便，易于操作。适宜于稀有、结构复杂的有机化合物的标记。缺点：无进行定位标记，且有机化合物主链上的原子无法标记，标记物的比放射性低。33四、放射性标记化合物制备的基本方法1、同位素交换法放射性核素与要标记的化合物中同一元素的稳定同位素相互交换来制备放射性标记化合物的方法。如：制备[G-3H]-河鱼屯毒素

可逆反应，反应速度的快慢与反应条件有关，常以交换半值期作为选择最适反应条件的指标。一般反应3-5个半值期即可。交换半值期的物理意义：产物的浓度等于交换反应达到平衡时产物浓度的1/2所需时间。影响交换反应速率的因素：温度、酸度、压力，所用溶剂性质，反应的浓度及选用合适的催化剂等。34同位素交换法的优缺点优点：方法简便，易于操作：不需制备前体，无复杂的合成步骤，待标记的化合物用量少(一般为mg级)，更适用淤标记稀有昂贵的复杂有机化合物，如反应条件选择适当，也可获得较高放射性活度与比活度，放射性核素利用率也可以很高。缺点：a.化合物的中心原子（如有机化合物主链上的原子）不易用交换法标记，所以用交换法制备标记化合物，最常用的放射性核素是氚和放射性碘，而14C标记化合物由于反应条件要求高，就不易用此法制备。b.如果在通常条件下，即不加温、不用特别的pH或不用催化剂等，就能交换的系统，亦不能用于制备标记化合物，因为这样的标记物，在一般生理条件下，标记原子亦易交换下来．c.如一个分子中有几个位置可以交换时，则标记位置不易有专一性．同样，

d.原料如含有杂质，且也含可交换位置，就会形成放射性杂质，故应特别注意同位素交换反应中待标记物的纯度．四、放射性标记化合物制备的基本方法2、化学合成法通过各种化学反应，将放射性核素引入到待标记化合物特定位置上的标记方法。优点：可以选择标记的核素、标记的位置（定位标记）、比放射性可以严格控制（比活度高），分离提纯容易（纯度高）。缺点：步骤多、流程长、费时费力。36化学合成法化学合成制备标记化合物最主要的方法，此法基于化学合成反应的原理，利用简单的放射性化合物作原料来制备所需的标记化合物．原则上凡能用化学合成法合成的化合物，均可用化学合成法制备标记化合物，其机理和方法与一般化合物合成没有本质区别。然而，毕竟制备的是放射性核素标记物，且在标记位置、活度、放化纯度等方面有特殊要求，因而与普通化学合成又有许多不同处：首先，在选用原料方面，制备标记化合物的起始原料大多只能用简单的无机物；其次，在选择合成路线时，要根据所需要的标记位置专门设计，力求使标记原子在分子中较稳定的位置或特定的位置上，并需考虑如何使放射性得率最高；另外，制备高比活度的标记化合物，需采用微量合成及分离纯化技术，一般需设计专门的微量合成装置，尽量采用低温、真空技术和避免高温、高压等剧烈反应，以减少放射性沾污。化学合成法化学合成法一般都应用非标记物进行充分的预试验(常称冷试验)，以选定最合适的制备路线及反应条件。本法能获得高比活度、高纯度而又是定位标记的标记化合物，这是其他制备方法所不能同时达到的，因此它是制备标记化合物的最主要方法。四、放射性标记化合物制备的基本方法3、生物合成法是利用生物(动植物或微生物)的生理代谢或酶的生物活性，将简单的放射性物质在体内或体外转化成所需的放射性标记物。如14CO2→加入藻类细胞中→产生的蛋白，含有16种标记的氨基酸。生物合成法又可分为“全生物合成”和“酶促合成”二类。前者常使用完整生物或某一器官的生理代谢进行生物合成标记，后者则利用生物组织中某种特定的酶，促进合成反应。以上二者，都是对某些放射性标记物，特别是一些构造复杂、化学合成难以制备或目前尚不可能制备的有机化合物进行标记的有用手段．393、生物合成法优点：可完全保留标记物原有的生物活性和旋光性，特别适合作生物示踪应用，可制备一些构造复杂、化学合成难以完成或目前尚不可能制备的有机物，如某些蛋白质、多糖、核酸、激素、生物碱及苷类等。缺点：1）生成物复杂，后续分离纯化步骤比较繁杂，放射性原料的利用率往往较低；2）除非所用原料的结构已接近生成物，否则很难标记在某一特定位置上；3）标记率比较低酶促合成是近年来很受注意的一种标记技术，对制备一些生物活性物质的定位标记物有一定发展前途，产品比活度也可较高，前提是必须有特异性高的酶制剂和高比活度的底物。40四、放射性标记化合物制备的基本方法4、络合物/螯合物生成法将放射性金属离子与特定的化合物进行络合和螯合反应，标记到化合物分子上的方法。优点：快速、定量、操作简易。临床上最常用的方法。缺点：对标记化合物的活性影响较大。41第三节

几种常用放射性标记化合物的制备42常用放射性标记化合物的制备14C标记化合物的制备氚标记化合物的制备放射性碘标记物的制备32P、33P和35S标记化合物的制备核酸和反义核苷酸的标记同位素交换法、化学合成法、生物合成法(2)制备：(1)核素特点：＊一、14C标记化合物的制备C处于化合物结构的骨架地位4414C标记化合物的化学合成常以Ba14CO3或14CO2为起始原料，由这些原料经一步或两步反应制备简单的14C标记化合物，这些中间体经常使用，有商品供应。如以Ba14CO3为原料制备14C-丙氨酸：45全生物合成最常采用的生物是细菌、绿藻、酵母等，这些低等生物代谢活泼，繁殖迅速，容易迅速低将简单的放射线原料(例如14CO2)掺入到细胞内。如利用蛋白质含量较高的小球藻在14CO2的环境中进行光合作用，使14CO2掺入到细胞内，生成含有14C的蛋白质、核酸及多糖14C标记化合物的生物合成462.酶促合成利用某些特定的酶通过一步或几步反应，将标记前身物转化为所需要的标记产物。例如：关键：有相应的前体和合适的酶14C标记化合物的生物合成47优点：来源丰富，可在反应堆大量生产；弱β-,射程短(4.5~6mm),无需外辐射防护；放射自显影分辨率高，可观察亚细胞形态标记简单，得率高、比活度高；T1/2长（12.33年）、易运输、贮存和安排实验。不足：C-H不如C-C牢固，易脱落；高比活度的氚标记物容易发生辐射自分解；同位素效应，注意标记位置远离反应部位。二、氚(3H)标记化合物的制备(1)核素特点：48二、氚(3H)标记化合物的制备(2)制备：同位素交换法、化学合成法、生物合成法氚气暴射交换溶液中的催化交换催化加氚法催化卤素置换法氚化金属还原法493H同位素交换法：直接将3H气体引入待标记分子中进行同位素交换反应。3H同位素交换法氚气暴射交换溶液中的催化交换故不常用！优点：简单、方便。缺点：易标记在不稳定位置上、化学键易断、反应时间较长、比活度低、纯化困难。50化学合成法是目前制备高比活度的氚定位标记的最成熟、最重要的方法。需要：1）合适前体：常用烯烃、炔烃、有机卤化物、腈及羧基化合物等；2）还原剂：氚气以及氚化金属，如NaBT4、LiBT4、KBT4、LiAlT4等。化学合成法催化加氚法催化卤素置换法氚化金属还原法51化学合成法之催化加氚法将含有不饱和键的前体（烯烃、炔烃、有机卤化物、腈及羧基化合物）溶解后在催化剂作用下和氚气反应数小时52化学合成法之催化卤素置换法在催化条件下，氚很容易与溴、碘原子发生置换反应（常加入少量有机胺类，中和反应产物卤化氚，有利于反应进行）53化学合成法之催化卤素置换法用氚化金属还原剂，如NaBT4、LiBT4、KBT4、LiAlT4等，它们可以选择性地将羧酸、酯、酮、醛和腈类化合物还原成相应的醇类或胺类而实现定位标记54主要根据“酶促反应”的原理，以氚的标记物为底物，利用专一性很强的酶作为催化剂，将该标记物转化成所需的另一种标记物生物合成法能定位标记，而且保留生物活性55√√√三、放射性碘标记化合物的制备56125I

T1/2＝60d标记物储存应用一段时间、商品化低能γ射线，无β粒子辐射分解少，标记物稳定性好三、放射性碘标记化合物的制备57CONHCH2COOHICONHCH2COOH131I+Na131IKIO3H+131I－邻碘马尿酸(一)同位素交换法HOIHO131I

Na131I150℃1h131I－6－胆固醇58(二)蛋白质、多肽的碘标记技术前提：1）待标记物要有易被碘原子结合或取代的基团，对蛋白质和多肽而言，最主要是酪氨酸，它易被碘化的部位是苯环上羟基的两个邻位。组氨酸和色氨酸残基也有一定活性。（箭头）2）必须先把125I-氧化成125I259Na125IHOCH2CHCOOHCH2CHCOOHHO125I+125I2NH2NH2125I－碘代酪氨酸氧化剂

Ch-T，H2O2标记原理：(二)蛋白质、多肽的碘标记技术60蛋白质、多肽的碘标记常用方法1、直接标记法氯胺-T法乳过氧化物酶法固相氧化法2、间接标记法61621.氯胺T法SO2NCH3NaCl+2Na125I+2H2OSO2NHCH3+125I2++NaCl2NaOH温和氧化剂63⑴反应液组成：

Na125I74MBq（10μL）

蛋白质5μg（10μL）

缓冲液（pH7.4）30μL

氯胺T100μg（10μL）

室温1~3min⑵加Na2S2O5200μg（0.2mL)中止反应⑶用SephadexG50柱层析分离纯化

125I-蛋白质6465氯胺-T是较强的氧化剂，对一些生物活性不稳定的物质，例如一些补体成分、某些激素、酶和受体都有一定的损伤662.乳过氧化物酶法乳过氧化物酶

+H2O2O2（新生氧）标记原理：Na125I125I267⑴反应液：Na125I37MBq（10μL）

缓冲液（pH5.6）30μL蛋白质5μg（10μL）乳过氧化物酶25ng（10μL）H2O2200ng

（10μL）室温7min⑷巯基乙醇（10mmol/L）0.5mL(中止反应)⑵H2O2200ng

（10μL）室温7min⑶H2O2200ng

（10μL）室温7min⑸加入NaI载体溶液,用SephadexG50柱层析分离纯化

125I-蛋白质68注意事项：1.乳过氧化物酶使用前新鲜配制2.H2O2保持低浓度：<0.1mmol/L3.酶的浓度↑，标记率↑酶的用量<1%标记蛋白↓酶自身碘化而引入的放化杂质69乳过氧化物酶-葡萄糖氧化酶法(LPO-GO)葡萄糖氧化酶＋葡萄糖H2O2标记原理：乳过氧化物酶O2（新生氧）Na125I125I270⑴反应液：Na125I37MBq（10μL）

缓冲液（pH7.0）30μL蛋白质5μg（10μL）乳过氧化物酶25ng（10μL）葡萄糖氧化酶10ng

（10μL）室温4~20min葡萄糖(0.5%)5μL(2)0.1%叠氮钠100μL中止反应(3)用Sephadex柱层析分离纯化714.固相氧化法固相酶法:将乳过氧化物酶等交联在琼脂糖凝胶上氯甘脲法:(Iodogen)NNNNOOClClClCl固相氧化剂（温和）1,3,4,6-四氯

3a,6a-双苯基甘脲72⑴1mg氯甘脲溶于25mL二氯甲烷，取50μL加入3mL试管中，用N2气吹干，在试管底部形成氯甘脲薄膜

-20℃条件下可保存半年（Iodogen管）(2)试管中加入：

Na125I37MBq（10μL）

缓冲液（pH7.4）30μL蛋白质5μg（10μL）室温3min(3)取出反应液，上柱分离纯化

125I-蛋白质特点：标记率高，标记蛋白损伤少杂质少，多为单碘化合物73二、74联接标记法(Bolton－Hunter法)CH2CH2C－O－NHOOOO125I125ICH2CH2C－O－NOHOOO+NH2－CHC－OCH2CH2C－HOO125I125INH－CHC－O3－(对羟基苯)丙酸－N－琥珀亚胺酯125I－标记蛋白质蛋白质分子末端氨基Na125ICh－T(联接试剂)75室温1~3min具体操作方法：⑴碘化：琥珀亚胺酯0.4μgNa125I74MBq氯胺－T50μg（10μL）Na2S2O5120μg（10μL)NaI2mg苯250μg(2)联接:分离上述苯液，移入试管，用N2气吹干后加入:蛋白质10μgPB(pH8)50μL室温10~30min甘氨酸(0.2mol)500μL0℃,5min(3)上柱分离纯化125I-标记蛋白质76优点:二步操作，避免蛋白质变性缺点:标记率低蛋白质接上琥珀亚胺酯，分子较大，影响活性7714C标记化合物的制备氚标记化合物的制备放射性碘标记物的制备32P、33P和35S标记化合物的制备核酸和反义核苷酸的标记主要用于标记核苷酸第四节放射性标记化合物的纯化和鉴定79没有被标记上的游离放射性核素，如碘标残存的125I；待标记物中杂质亦被标记，如蛋白标记中的杂蛋白；标记后形成的杂质，如在储存期内，或者由于标记物本身的不稳定，或者由于辐射自分解，产品的性质、结构等可能发生变化而形成的放射性杂质，所以标记结束一段时间后再用的化合物需要进行重新的纯化鉴定。一、放射性杂质的来源放射化学纯度要高(>95%)，在示踪过程中要稳定80标记率：指放射性核素被标记到待标记化合物上的量占放射性总的投入量的百分比。标记率(%)=标记物的放射性/投入的总放射性×100%测定方法：最常用纸层析或薄层层析法，对于生物制剂有时也用柱层析或蛋白沉淀法。二、标记率的测定81常用测定方法：1、纸层析法：混合样品中各组分的性质不同，在固定相上的吸附能力和在流动相中的溶解度不同，因此它们各自的移动速度不同，可在特殊纸片上分离开。

常用比移值Rf表示各组分的移动速度快慢。意义：某标记物的Rf值在相同条件下稳定不变。Rf=待测组分到原点的距离I

流动相前沿到原点距离L标记率测定之分段测量法83标记率测定之放射线扫描法84展开实验注意问题层析纸长度，一般20cm左右，越长分离越好；展开剂要精心设计，选2-3种进行验证。要求：能把混合物很好的分开，用时还要组成简单，粘度小，展开快，展开后易挥发，价格低，易购买。点样斑大小适当。点样斑不能碰到展开剂的液体。层析缸要有盖，减少干扰。分段测量，段的大小要一致；起跑点所在段也要测量；高比活度样品点要加载体，减少吸附；避免反复点样，层析纸要自然晾干；最好能用标准样品做对照；各段剂量值必须减本底。862、薄层层析法：硅胶或氧化铝（固定相）：根据混合物各组分的吸附力和分配系数不同而分开。离子交换树脂（固定相）：根据各组分离子电荷的性质和数量不同而分开。聚酰胺：以各组分氢键吸附能力不同而分开。常用方法：1.层析法（1）纸层析（2）薄板层析（3）柱层析（如凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析）2.透析法3.电泳法三、标记物的分离纯化881.层析法（1，2）纸层析法和薄板层析法：原理和操作与标记率的测定类似，最后，根据标准品所显示的位置，将纯化产品剪下（纸）或刮出（板），用适当的溶剂（水或乙醇等），将标记物浸泡提取出来，并进行鉴定。特点：简便、快速，但仅能适用于少量体积的样品的纯化。89（3）柱层析法：原理：将固定相装在一定体积的玻璃柱（或金属柱）中，层析柱经处理之后，将样品加到固定相之上，然后用洗脱液淋洗，样品中的各种化合物，或者由于吸附、分配的差异，或者由于离子荷电的差异，或者由于分子量的差异等等，从层析柱上被淋洗出来的速度有所不同，各组分的洗出也有先后，从而达到分离的目的。90（3）柱层析法：根据被纯化物的性质，采用不同内容的层析柱和选择合适的淋洗条件：凝胶过滤层析法：本法是利用具有分子筛效应的多孔网状凝胶来分离不同分子量的化合物。由于小分子物质可进入凝胶粒子的网孔内部，而较大分子物质进不去，因此，在淋洗层析柱时，小分子物质推进速度慢，而大分子物质却沿着凝胶粒子间的缝隙最先被洗脱出来，从而达到分离的目的。凝胶主要有三类：sephadex交联葡聚糖多孔凝胶；sepharose或biogel-A琼脂糖珠；biogel-P聚丙酰胺91离子交换层析法：依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。电荷不同的物质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。亲和层析法：对于具有较强特异性结合作用的抗体和抗原，受体和配基等亲和性的互补物，可将其中的一种结合在层析柱的固定相上，例如将某抗原固定在层析柱的介质上，的那个含有相应抗体的样品通过层析柱时，由于抗原-抗体的结合反应，抗体被滞留在柱上，经洗涤将抗体中各种非特异性的杂质洗掉，完后改变洗脱液的浓度或pH值，将抗体洗脱出来，这种利用亲和层析载体固相化配基与亲和互补物之间，通过范德华力、疏水力、静电力、氢键作用等发生专一性结合而进行分离的技术称之为亲和层析法。922.透析法根据标记物和放射性杂质的分子量大小的不同，选择孔径合适的透析袋，将样品置于透析袋