鸡CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂制备技术规程

鸡CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂制备技术规程范围本标准规定了鸡特异性CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂的制备、检测、贮存等方面的技术规程。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法术语与定义下列术语和定义适用于本文件。CpG寡脱氧核苷酸CpGoligonucleotide，CpGODN含有未甲基化的CpG二核苷酸基序的核酸序列，能够在机体内诱导强烈的免疫反应。硫代修饰phosphorthioatemodified将核酸序列磷酸二酯键中的非桥氧原子置换成硫原子，主要用于防止反义实验中核酸被核酸酶降解。熔解温度meltingtemperature，Tm在DNA双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收、纯化目的DNA。OD值opticaldensityvalue表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用OD值表示。试剂或材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯。水：符合GB/T6682—2008一级水规定。三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）缓冲液：附录A.1。生理盐水。去内毒素质粒大提试剂盒。仪器设备微量移液器：2.5uL、10uL、200uL、1000uL。高速离心机：离心力＞13000转/分钟。无菌注射器：1mL、5mL。冰箱：低于-20℃。紫外分光光度计：波长范围200nm～380nm。超净工作台或生物安全柜。天平：精度0.1mg。滤器：0.45um。恒温摇床：振荡频率10～400转/分钟，温度范围为室温～70℃。佐剂的制备单链形态佐剂的制备鸡种属特异性CpGODN序列：5’-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3’，全链或两端硫代修饰，分子量6782.43g/mol，Tm值58.01。序列由生物公司合成，采用PAGE及以上纯化方式纯化，建议合成量20OD/管，分装2管。双链形态佐剂的制备重组质粒的构建目的片段为含8拷贝鸡种属特异性CpGODN序列（同6.1）的基因片段。目的片段5’端添加SalI酶切位点（gtcgac），3’端添加XhoI酶切位点（ctcgag），单拷贝序列间以碱基CTAGA连接。目的片段和原核表达质粒pET21a分别经SalI和XhoI内切酶双酶切后，使用T4DNA连接酶进行重组连接。将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，在LB固体培养基（附录A.2）平板上37℃倒置培养约8～12小时后，挑取单克隆菌落至LB液体培养基（附录A.3）中，37℃条件下进行摇动过夜培养。重组质粒的提取用去内毒素质粒大提试剂盒进行重组质粒的提取。提取操作参照试剂盒说明书进行。用0.45um的滤器过滤提取质粒，去除细菌、蛋白等杂质。纯净的双链重组质粒形态稳定，无需硫代修饰。检测单链形态合成产品取一支CpGODN佐剂合成品（含10ODCpGODN）放入高速离心机，12000转/分钟离心3～5分钟，加水5mL，溶解混匀后取100uL，加入光径为1cm的石英比色杯，然后加入900uL水，混匀后用紫外分光光度计测定260nm处的数值，如为0.2证明CpGODN含量正常，如低于0.2说明CpGODN含量过低，合成量不足。双链形态重组质粒取CpGODN重组质粒20uL，加入980uL水对质粒样品进行50倍稀释后加入光径为1cm的石英比色杯，用紫外分光光度计分别测定260nm和280nm处的数值，当OD260/OD280在1.8～1.9之间时，且根据质粒浓度计算公式得出的重组质粒浓度高于1500ug/mL时方可应用。其中，质粒浓度计算公式为50×OD260值×稀释倍数（单位为ug/mL）贮存单链形态合成产品CpGODN合成产品为干膜状物质，长期贮存应在-20℃以下。已用水或TE缓冲液溶解配制的CpGODN佐剂应尽快使用完毕，短期-20℃以下冷冻保存，避免反复冻融。双链形态重组质粒CpGODN重组质粒溶解于水后应于-20℃以下冷冻保存，避免反复冻融，有效期不超过12个月。操作注意事项CpGODN佐剂的制备产品和贮存应保证无菌。CpGODN重组质粒的转化和培养应保证无外源菌感染。CpGODN合成产品呈无色干膜状，质轻，打开时极易散失，故开盖前需离心。CpGODN佐剂现用现配（制备），尽快用完，以减少核酸的降解。说明本标准规定的CpGODN佐剂可用于疫苗生产企业生产疫苗和养殖企业稀释疫苗。本标准规定的CpGODN佐剂可用于鸡用冻干疫苗和液体疫苗。

（资料性附录）

试剂的配制TE缓冲液1×TE缓冲液1L中含1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH8.0）10mL0.5M乙二胺四乙酸（pH8.0）2mL加水定容至1L，高压灭菌，室温保存。LB固体培养基1LLB固体培养基中含胰蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10gX脂粉15g加水950mL，溶解后用1M的NaOH调节pH值到7.0，定容至1L，高压灭菌，待冷却至50℃～60℃时，加入1mL氨苄青霉素（100mg/mL）后混合均匀，倒制平板。LB液体培养基1LLB液体培养基中含胰蛋白