细菌学检验-14-螺旋体课件

第十四章螺旋体（Spirochaete）概述定义：是一类细长，柔软，螺旋状，运动活泼的原核细胞型微生物。结构：与细菌相似，如有细胞壁、原始核，以二分裂方式繁殖，对抗生素敏感等，但无鞭毛。分布：存在于水、土壤、腐败有机物；寄生于动植物、正常人口腔、正常阴道偶见。致病性螺旋体：主要有钩端螺旋体属、疏螺旋体属、密螺旋体属等3个属。A密螺旋体属

B钩端螺旋体属C疏螺旋体属第一节钩端螺旋体(Leptospira)

螺旋细密和规则(有几十个)，一端/两端弯曲使菌体呈钩状故名钩端螺旋体。问号钩端螺旋体：致病性。双曲钩端螺旋体：非致病性。一、微生物特性(一)形态染色G－，但不易着色。常用Fontana镀银染色法，被染成棕褐色。暗视野显微镜下可见活泼运动、折光性强而成白色的钩端螺旋体。轴丝紧紧缠绕在原生质圆柱体表面呈螺旋状，使钩端螺旋体活泼地沿长轴旋转运动。钩端螺旋体(二)培养特性营养要求较高，常用含10％兔血清的柯索夫（Korthof）培养基（兔血清除促进钩端螺旋体生长外，尚有中和代谢产物毒性的作用）。最适生长温度为28℃～30℃，最适pH为7.2～7.6。人工培养基中生长缓慢。在液体培养基中，分裂一次需8～lOh，培养一周左右，呈现为半透明云雾状生长（液面1cm的部位最丰富），但菌数仅相当于普通细菌的1/10—1/100。(三)分类

(1)抗原分类属特异性蛋白抗原——只存在于钩体属中群特异性抗原——脂多糖型特异性抗原——多糖蛋白复合物根据抗原性不同问号钩体分25个血清群、273个血清型。我国已发现致病性钩体至少19群，74型。我国目前使用的问号钩端螺旋体参考株有14群15型。

(2)DNA分类：问号状钩体分7个基因种血清学分群和分型应用显微镜凝集试验和凝集素吸收试验，问号状钩端螺旋体可分为25个血清群、273个血清型，其中我国至少存在19个血清群、74个血清型。我国目前使用的问号钩端螺旋体参考株有14群15型。(四)抵抗力

对热抵抗力弱，60℃、1min即死亡。0.2％来苏、l：2000升汞、1％石炭酸经10～30min被杀灭。对青霉素敏感。钩端螺旋体在夏秋季酸碱度中性的湿土或水中可存活20天以上，甚至数月之久，这在本菌的传播上有重要意义。二、致病性与免疫性

引起人畜共患病，鼠类和猪是储存宿主。传染源和储存宿主：鼠类、猪等。动物感染->多不发病->在肾脏长期繁殖->尿->排出->污染土壤和水源(疫水、疫土)。传播途径：－接触疫水、疫土经口、皮肤粘膜感染。致病物质：溶血素－>溶血；细胞毒因子；内毒素样物质二、致病性与免疫性

所致疾病：引起钩端螺旋体病。钩体可穿透完整皮肤粘膜侵入机体，并引起钩体血症，产生如内毒素等物质，出现发热、头痛、肌痛、眼结膜充血等中毒症状，患者有全身毛细血管损伤和微循环障碍，并引起CNS、心、肺、肝肾功能损害。感染后2周螺旋体可随尿液排出。二、致病性与免疫性

临床类型：由于血清型、毒力数量不同以及免疫水平差异，有以下类型①流感伤寒型；②黄疽出血型；③肺出血型；④脑膜脑炎型；⑤肾功能衰竭型；⑥胃肠炎型等类型。临床类型：①黄疸出血型又称外尔病(Well'sdiscase)

败血症、出血、黄疸与肝肾损害等。②流感伤寒型又称沼泽热(marshfever)

如流感或伤寒，较轻，内脏损害较少。出血是钩体病最常见的临床表现。免疫性

对同一血清型有牢固免疫力，主要为体液免疫。特异性抗体(

1～2w):调理，吞噬增强血流中:被清除肾脏内:不易被清除->尿中排菌:数周、数月、数年三、微生物学检查标本采集直接检查暗视野显微镜:活菌镀银染色:死菌分离培养：Korthof培养基培养动物试验：豚鼠血清学试验：查抗体1、标本采集钩端螺旋体可从临床标本、携带者和自然界的水中分离获得。标本采集包括血液（发病1周）、尿（2周）和脑脊液（脑膜刺激症），发病早期(1周内)血液的阳性率高，1周后尿和脑脊液等的阳性率高。感染6～10天取血可检出抗体，在病程第3或4周达最高水平，此后抗体水平逐渐下降，血清学诊断则需在病程早期及恢复期分别采集血清，作双份血清试验。2、标本直接检查

1．取急性期病人血以4000r／min离心45-60min，取1滴沉淀物置玻片上，加盖玻片后作暗视野检查。也可用Fontana

镀银染色法染色后观察。2．核酸检测采用同位素或生物素、地高辛标记的特异DNA探针法，检出标本中钩端螺旋体的核酸，较培养法快速、敏感。若先用PCR技术先行扩增，再用探针确定，则敏感度更加提高。3、分离培养

取钩端螺旋体血症期的病人血液2ml或发病后第2周的无菌弱碱性尿沉渣接种于Korthof培养基中，28℃孵育，因系需氧生长，故靠近培养液面呈半透明雾状混浊。取培养物作暗视野检查，观察有无螺旋体生长。连续观察30d，如无生长方判为阴性4、动物试验动物是分离钩端螺旋体的敏感方法，尤其适用于有杂菌污染的标本。方法是将标本接种于幼龄豚鼠或金地鼠腹腔。接种3～5d后，可用暗视野显微镜检查腹腔液；亦可在接种后3～6d取心血检查并作分离培养。动物死后解剖，可见皮下、肺部等有大小不等的出血斑，肝、脾脏器中有大量钩端螺旋体存在。5、抗体检测1）、显微镜凝集试验是常用的方法。(1)抗原制备：取标准菌株4—7天的培养物，每视野50～60条活钩端螺旋体。(2)方法与结果：取病人血清以56℃，30min灭活后稀释，每个稀释度0．1ml血清中加入等量活菌抗原，30℃2h后，取1滴覆盖玻片，暗视野显微镜下若有抗体存在，则钩体凝集成团，数减少，菌体溶解。结果判定：50％以上菌体凝集或溶解为“2+”为血清效价。达1：300以上才有诊断意义或效价增高4倍以上，则可确诊本病。还可作钩体的定群、定型试验。显微镜凝集试验2）、酶联免疫吸附试验用ELISA法和IgM斑点-ELISA法等间接检测钩体病人血清中特异性抗体，用于该病的快速诊断。包被抗原用钩端螺旋体培养物经超声波破碎，15000r／min离心20min，用于包被的抗原浓度以20μg／ml为好。被检血清OD值为阴性对照的2倍，即为阳性。四、防治原则

预防:防鼠、灭鼠家畜管理保护水源预防接种:死疫苗治疗:青霉素、安比西林、庆大霉素、强力霉素等

第二节密螺旋体属螺旋细密、规则两端尖，数目多；包括致病性和非致病性两大类。致病密螺旋体有苍白和品他密螺旋体两个种。苍白密螺旋体又分3个亚种：苍白亚种、地方亚种和极细亚种，它们分别引起梅毒、是性传播疾病。地方性梅毒通过污染餐具传染，雅司病经直接接触患者皮肤受损部位而传染，二者的临床症状与梅毒相似，但不是性传播疾病。品他密螺旋体引起人类品他病。一、梅毒螺旋体引起梅毒。人是惟一传染源。先天性梅毒：通过胎盘由母体传染胎儿，获得性梅毒：经性接触传播。也可经输血引起。（一）所致疾病获得性梅毒，临床上分为三期：Ⅰ期：感染后3周左右局部出现无痛性硬下疳。多见于外生殖器；感染性极强。Ⅱ期：发生于硬下疳出现后2~8周。全身皮肤、粘膜常有梅毒疹，全身淋巴结肿大；Ⅲ期：发生感染2年后，病变可损害全身组织和器官。基本损害为慢性肉芽肿，病损内螺旋体少但破坏性大。Ⅰ期（初期）梅毒：硬下疳Ⅱ期梅毒:梅毒疹Ⅱ期梅毒：梅毒疹Ⅲ期梅毒的溃疡、坏死所致疾病先天性梅毒－又称胎传梅毒。引起胎儿全身性感染，多发于妊娠4个月之后。导致流产或死胎；呈现马鞍鼻、先天性耳聋等特殊体征。先天性梅毒——锯齿形牙（二）微生物特性

1．形态与染色有8～14个致密规则小螺旋，两端尖直运动活泼，G-，但不易着染。Fontana镀银染成棕褐色。在光镜下易于查见。在暗视野显微镜下，可观察标本形态和运动方式。密螺旋体苍白亚种

暗视野×40002.电镜下观察，有细胞壁和细胞膜。细胞壁外有包膜，细胞膜内为含细胞质和核质的螺旋形原生质圆柱体。绕着3—4根周浆鞭毛或内鞭毛，与运动有关。3.不能在无活细胞的人工培养基中生长繁殖。将Nichols有毒株接种家兔的睾丸,缓慢增殖,将其转种含多种氨基酸的兔睾丸组织中,可失去致病力,称Reiter株。4.抵抗力极弱。对温度和干燥特别敏感，4℃3天死亡。保存4℃3天血液就无传染梅毒的危险。梅毒螺旋体检验1.直接显微镜检查

初期梅毒，取下疳分泌物；二期梅毒取梅毒疹、病灶渗出物或局部淋巴结穿刺液，将上述检材置于玻片上用暗视野显微镜检查，如见有呈现运动活泼，沿其长轴滚动、屈伸、旋转、前后移行等的螺旋体即有诊断意义。2.核酸检测用PCR技术直接检测:临床标本中梅毒螺旋体的特异性DNA片段，用于检测的引物和探针是编码外膜蛋白4．7kD的基因，其扩增产物经斑点印迹，或电泳以Southern印迹法鉴定。3.抗体检测

(1)非密螺旋体抗原试验（非特异性抗体检测）多用牛心肌的心脂质（作为抗原，测定病人血清中的反应素（抗脂质抗体）。初期梅毒病灶出现后1-2周时，阳性率为53％～83％，二期梅毒的阳性率可达100％，晚期梅毒的阳性率58％-85％，胎传梅毒的阳性率为80％-100％。1)性病研究所实验室

(VDRL)玻片试验所用VDRL抗原(0．03％心拟脂、0．21％卵磷脂、0．9％胆固醇，用无水乙醇配制)0．3ml加入装有0．3ml缓冲盐水的小瓶内(10—15ml容积)，加塞混匀。再加2．4ml缓冲盐水即为抗原悬液，待检血清经56℃30min灭活，滴加于玻片的漆圈内加等量抗原液，摇转玻片5min充分混匀反应后观察结果。有大片絮状凝聚物为(3+)，中等凝聚物为(2+)，细小凝聚物为(+)，液体混浊为(—)。2)快速血浆反应素环状

卡片试验(RPR)用活性炭颗粒吸附VDRL抗原。与反应素结合形成黑色凝集块，可肉眼观察结果。取待检血清加于环状卡圆圈内，加VDRL抗原致敏活性炭1滴，旋转摇匀8min，观察结果。在白色底板出现明显黑色凝集颗粒为阳性，试验结果用肉眼很容易判断，不需显微镜，也易于推广。以上两实验用于梅毒的初筛实验(2)密螺旋体抗原试验用密螺旋体抗原检测病人血清中特异性抗体，由于梅毒螺旋体、雅司螺旋体等抗原性相似，所以用血清学试验不可能区别这些密螺旋体及其所致疾病。

1)荧光密螺旋体抗体

吸收试验(FTA-ABS)

先用吸收剂去除病人血清非特异性抗体，提高特异性，稀释成不同稀释度，加于预先涂有梅毒螺旋体抗原的玻片上，置湿盒内，37℃孵育30min，洗片后再用荧光素标记的羊抗人丙球蛋白抗体，在荧光显微镜下观察。阳性者可见发荧光的梅毒螺旋体。FTA-ABS试验具高度特异性和敏感性，在第一期梅毒的头几天就可测出特异性抗体。

2)梅毒螺旋体荧光抗体

双染色试验(FTA—ABS-DS)

用Nichol株梅毒螺旋体作抗原，用四甲基异硫氰酸若丹明结合的抗人球蛋白抗血清及异硫氰酸荧光素(FITC)结合的抗梅毒螺旋体球蛋白双重染色，用间接免疫荧光技术检测血清中的抗TPlgG抗体。FTA-ABS-DS法无论对早期梅毒或晚期梅毒都有很高的敏感性和特异性，且阳性出现时间早。一期梅毒阳性率达90％，晚期梅毒的阳性率为95％。对确诊病人的敏感性和特异性分别为91．7％和92．o％，但技术要求较高，且较费时费钱，因此多用于实验室试验。3)抗梅毒螺旋体抗体的微量

血凝检测(MHA-TP)

用抗原致敏红细胞作间接血凝试验是检测抗体最简易的方法，所用抗原是用梅毒螺旋体(Nichols株)提取物去致敏经醛化处理的绵羊红细胞，病人的血清先与非致病性Reiter细胞结合。血清若含有抗体则与这些细胞反应形成平铺孔底的凝集；用非致敏红细胞作对照，以除外非特异性凝集。4)ELISA用Nichols株为抗原，以超声波击碎。此法可用于各期梅毒诊断，灵敏度为96％，对感染血清灵敏度为95％。与荧光抗体双吸收法(FTA-ABS-DS)比较，两法符合率为96％。ELISA试剂具有价廉、保存时间久且稳定(4个月)等优点，是目前梅毒血清学诊断试验的首选方法。

5)免疫印迹试验

(immuno-blottingtest)将梅毒螺旋体抗原用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)后，再将凝胶中的抗原经电转移至硝酸纤维薄膜上，将膜切成1．5mm宽小条。试验时加病人血清20μl(1：100稀释)，置摇床上室温过夜，次日用洗涤液洗3次后，加辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗血清(1：500稀释)，室温作用1小时后，加底物显色5min后用蒸馏水冲洗，终止反应。出现蓝色区带为阳性。WHO推荐用VDRL、RPR法对血清进行过筛试验，出现阳性者用FTA-ABS、FTA-ABS-DS、MHA-TP、ELISA和免疫印迹试验等方法做确认试验。先天梅毒很难诊断，可用RPR半定量试验每月检测1次，连续6个月，检测反应素效价，或用VDRL定量试验查抗体效价变化。如效价增高或稳定在高水平，表明是先天梅毒。如抗体是来自母体lgG，通常在2～3月内消失。二、其他密螺旋体有苍白密螺旋体地方亚种、极细亚种以及品他密螺旋体，分别引起地方性梅毒、雅司和品他病。大多发生于经济较落后地区的儿童。微生物学检查，可从皮肤标本直接在暗视野显微镜下观察有无密螺旋体。也可用血清学试验检测血清中有无相应抗体。由于与梅毒病原体形态、抗原结构，DNA同源性基本相同，无法区别。因此，查到密螺旋体及血清试验阳性只能诊断为密螺旋体感染，还必须结合临床表现确定。第三节疏螺旋体属

有3～10个稀疏而不规则的螺旋，运动活泼。对人致病的主要有伯氏疏螺旋体、回归热螺旋体、奋森螺旋体等。一、伯氏疏螺旋体是莱姆病的主要病原体，1977年在美国莱姆镇发现，从硬蜱及患者体内分离出伯氏疏螺旋休。1985年我国在黑龙江省林区首次发现莱姆病，1988年从病人血液中分离出病原体，迄今已有十多个省和自治区证实有莱姆病存在。传播媒介是硬蜱，伯氏疏螺旋体可在蜱的中肠生繁殖，叮咬时使宿主感染。经3～30d潜伏期，在叮咬部位可出现慢性移行性红斑。经2-3周，皮损消退，留有斑痕与色素沉着。早期症状有头痛发热、肌痛等。80％未经治疗的可发展至慢性关节炎、慢性神经系统异常，严重者可同时出现皮肤、神经、关节、心等多脏器损害。硬蜱莱姆病Lymedisease游走性红斑微生物特性

1．疏螺旋体，两端稍尖。运动活泼，在培养基中，不规则地缠绕一起，呈卷圈状。周浆鞭毛数不等。与运动有关。Ｇ-易着色。

Giemsa或Wright染色均佳。2．抗原成分主要的有鞭毛蛋白(40kＤ)、外膜蛋白A(OspA)、B(OspB)和C(OspC)，60kD抗原。40kD鞭毛蛋白既是免疫原，也是致病原之一。3.营养要求高，培养基需含有长链饱和与不饱和脂肪酸、葡萄糖、氨基酸和血清蛋白等。微需氧，5％—10％C02促进生长。适宜温度为35℃。生长慢，1代需18h，需培养1～3周观察到生长情况。伯氏疏螺旋体

微生物检验

1．标本采集早期取病损皮肤组织、淋巴结抽出液、血液。2.直接用暗视野显微镜，观察关节滑膜液、脑脊液、尿液等标本中螺旋体的形态和运动，因数量太少，故在实验室诊断中价值不大。用于蜱内脏组织检查,检出率较高。

3.核酸检测

用PCR技术检查DNA:方法快速、敏感性高，用已知引物，以标本中螺旋体质粒DNA片段为模板，扩增后形成309bp的DNA分子(是编码OspA的基因片段)，经琼脂糖电泳证实。此DNA分子在所有伯氏疏螺旋体菌株中均可被检出，而其他菌种则为阴性。4.分离培养标本接种在BSK复合培养基中，33℃孵育。BSK培养基是含有牛血清白蛋白(BSA)和热灭活兔血清等营养丰富的液体培养基，通常从感染的脾中分离螺旋体较易，而从损伤皮肤中分离较难。因分裂1代需12h以上，需培养2-3周可观察生长情况。5.抗体检测间接免疫荧光法(IFA)：将螺旋体在BSK中培养5-7天，离心8200rpm30min收集螺旋体，稀释至200个螺旋体／高倍镜视野。取20μl悬液于玻片上，干燥后用丙酮固定5min。待检血清以PBS倍比稀释，加于玻片10～15μl稀释血清，湿盒内37℃孵育30min，洗后加荧光素标记抗人IgG。IFA操作简便实用，但类风湿性关节炎和其他螺旋体病可