诊断酶学自编

诊断酶学自编第一页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述

通过本节学习，掌握的知识点1、酶的组成、结构及功能特点。2、酶的催化机制。3、什么是同工酶，LDH、CK等同工酶的分布及临床意义。4、何谓工具酶，工具酶参与的指示反应。5、终点法和动力学法测定代谢物浓度的原理及区别。第二页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述一、酶的概念与特征（一）、酶的概念：

酶是活细胞分泌产生的具有催化活性的蛋白质或RNA。第三页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述（二）酶的组成及功能按照酶的分子组成：

单纯酶：酶蛋白结合酶：金属离子辅助因子

小分子有机化合物

第四页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述（三）、酶的催化作用机制1、酶的活性中心：

酶分子中能和底物特异性结合并将底物转化为产物的区域称为酶的活性中心。

第五页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述2、诱导契合学说在酶促反应中，酶与底物结合时，底物首先和酶分子上的活性中心相结合，形成酶-底物中间复合物（ES）。在构象上相互诱导，致使活性中心与底物完全紧密结合，这一过程称为诱导契合学说。第六页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述（四）酶促反应动力学1、底物浓度对酶促反应速度的影响2、酶的浓度对酶促反应速度的影响3、温度、PH、激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响。第七页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述二、同工酶的概念与特征1、概念

指催化相同的化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。第八页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述二、同工酶的概念与特征2、特征（1）同工酶是由不同基因编码的多肽，或由同一基因转录生成的不同的mRNA所翻译的不同多肽链组成的蛋白质。（2）同工酶存在同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中，它使不同组织、器官和不同的亚细胞结构具有不同的代谢特征。第九页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述二、同工酶的概念与特征3、临床常用的同工酶第十页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述二、同工酶的概念与特征3、临床常见的同工酶（1）LDH：

该酶是四聚体酶，由两种亚基类型即骨骼肌型（M）和心肌型（H）。种类：LDH1，LDH2，LDH3,LDH4，LDH5。主要分布于心肌，红细胞，骨骼肌和肝脏中。第十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述二、同工酶的概念与特征3、临床常见的同工酶（2）CK——肌酸激酶

该酶是二聚体酶，有两种亚基类型即骨骼肌型（M）和脑型（B）。该酶有三种：CK1—脑中

CK2—心肌

CK3—骨骼肌

第十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述二、同工酶的概念与特征3、人体重要的同工酶（2）CK——肌酸激酶

CK

肌酸+ATP磷酸肌酸+ADP

血清中CK2的活性测定有助于心肌梗死的早期诊断。第十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（一）定义：

酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工具酶。第十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（二）工具酶参与的指示反应1、利用特异性较高的氧化酶产生过氧化氢，再通过加氧化发色剂进行比色的方法第十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（二）工具酶参与的指示反应例：多胺氧化酶多胺氨基酸+H2O2+NH3+H2O2和4-AAP（氨基安替比林）显色反应。第十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（二）工具酶参与的指示反应2、NAD（P）H在340nm具有特征性光吸收，NAD（P）+在340nm处不具有特征性光吸收，利用氧化-还原酶反应使其连接到NAD（P）+/NAD（P）H正/逆反应中，通过该两种物质量的变化间接反应待测酶的活性。第十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（二）工具酶参与的指示反应例：己糖激酶法测定血清中葡萄糖浓度己糖激酶葡萄糖+ATP6-磷酸葡萄糖+ADP

6-磷酸葡萄糖脱氢酶

6-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖酸

NADP+NADPH+H+

第二十页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（三）酶循环法1、定义：采用两类工具酶进行循环催化反应，使被测物放大扩增，从而提高检测灵敏度。第二十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（三）酶循环法2、实例：酶循环法测定总胆汁酸第二十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（三）酶循环法2、实例：酶循环法测定总胆汁酸

解释：硫代-NADH在405nm处有强值，胆汁酸的浓度与此处吸光值的变化成正比。△A/min（样品）总胆汁酸浓度=△A/min（标准品）

第二十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（三）酶循环法3、优势：（1）特异性好（2）反应温和，无污染。（3）灵敏度高第二十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（四）代谢物浓度的酶法测定技术

1、终点法（end-pointassay）

（1）定义：在代谢物酶促反应中，随着时间的延长，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后反应趋于平衡，测定反应达到平衡后待测物（底物）或产物的变化总量。第二十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（四）代谢物浓度的酶法测定技术1、终点法（end-pointassay）（2）终点法测定的基本条件：①待测物浓度〔S〕应远远小于其米氏常数Km，此时任何时刻的反应速率

V=Vmax〔S〕/Km②反应配方中所用的酶量(V)应足够大，而Km应小，以保证有较快的反应速度完成测定。第二十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（四）代谢物浓度的酶法测定技术

1、终点法（end-pointassay）

（3）种类

直接法：待测物和产物在理化性质上有可直接进行检测的差异，可以直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析。第二十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（四）代谢物浓度的酶法测定技术

1、终点法（end-pointassay）

（3）种类酶偶联法：

如果酶促反应的底物或产物无可直接检测的成分，则可将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中而达到的检测目的。第二十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述酶偶联法：

EXEiABCEx：为辅助酶Ei：为指示酶C：被检测的物质第二十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述酶偶联法（实际例子）：

血浆葡萄糖测定的氧化酶法（GOD）葡萄糖氧化酶葡萄糖+水+氧葡萄糖酸+H2O2

过氧化物酶

4-氨基安替比林+酚+H2O2红色醌类化合物+水+氧

色原性氧受体第三十页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（四）代谢物浓度的酶法测定技术1、终点法（end-pointassay）（4）终点法实验设计的考虑因素①工具酶的特异性高特异性②Km大小合适：在保证测定线性的前提下，Km值要尽量小。第三十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（四）代谢物浓度的酶法测定技术1、终点法（end-pointassay）（4）终点法实验设计的考虑因素③酶的用量：酶的用量足够大，保证反应在较短的时间内完成。④工具酶中的杂酶应低于允许限制。⑤反应平衡点：保证反应朝正反应方向进行⑥附加剂：反应中添加的附加剂不抑制酶的活性，不影响试剂稳定性，不与底物或反应液中的物质发生作用。第三十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（四）代谢物浓度的酶法测定技术2、动力学法（定时法）：

（1）定义：根据固定时间内底物消耗量和产物生成量计算酶的活性。（2）原理：当酶促反应为一级反应时，反应速度V=K〔S〕。此时测定酶促反应的初速度，根据标准浓度法即可求得待测物的浓度。

第三十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第一节概述三、工具酶（四）代谢物浓度的酶法测定技术2、动力学法（定时法）：（3）条件：实际操作中在底物浓度消耗小于5%时即可采用该方法。第三十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术通过本节的学习掌握如下知识：1、血清酶活性浓度测定技术有哪些？2、酶活性浓度定量系数K值的计算与实验室的应用。3、临床酶学测定的标准化要求和临床意义。4、酶活性浓度单位？目前通用的酶单位的表示方法有哪些？5、酶质量免疫化学测定法的原理和优缺点6、同工酶分析方法及原理第三十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术

定时法酶活性测定连续监测法酶学测定方法酶质量测定：免疫酶法第三十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术一、酶活性测定（一）定时法测定酶活性（动力学法）1、定义

在足量底物系统中，加入一定量的酶试剂，反应一定时间后，加入终止试剂终止反应，然后测定该段时间内底物消耗量或产物的生成量计算酶的活性。第三十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术一、酶活性测定（一）定时法测定酶活性（动力学法）2、定时法计算酶活性假设某一样品的酶活性为X（U/L），取样品Vs（ml）与底物缓冲液Vr（ml）孵育，经反应后，加入终止液Ve（ml），检测到产物净吸光度增加为A，该产物的摩尔消光系数ε，比色杯光径为b（cm）。第三十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术一、酶活性测定（一）定时法测定酶活性（动力学法）2、定时法计算酶活性第三十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期二定时法中可能引起的误差3、消除误差方法：做预实验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间，然后在该段时间内测定。第四十页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（二）、连续监测法测定酶活性（终点法）

1、定义：

连续监测法是将酶和底物在特定的条件下孵育，每隔一定时间（2-60s）连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率。第四十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术第四十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术3、分类（1）、直接法

直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化，从而计算出酶活性浓度。第四十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（2）、间接法——酶偶联反应

ExEiABCExEaEiABCD

Ex：待测酶Ea：辅助酶Ei：指示酶第四十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术采用酶偶联法测定酶活性前提：延滞期越短越好第四十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术采用酶偶联法测定酶活性前提：指示酶量的选择标准①Vx/（Km）x=Vi/（Km）iVx：测定酶的测定上限（Km）x\（Km）i是测定酶和指示酶的Km值。第四十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术采用酶偶联法测定酶活性前提：指示酶量的选择标准②米-曼氏方程

Vx=

Vi=Vx[1+]Vi×PP+（Km）i（Km）iP第四十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术采用酶偶联法测定酶活性前提：指示酶量的选择标准③第四十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（三）干扰因素1、其他酶和物质的干扰2、酶的污染3、非酶反应4、分析容器的污染5、沉淀形成第四十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（四）血清酶活性浓度测定条件的优化1、方法的选择2、仪器和设备3、试剂4、自动生化分析仪参数的设置第五十页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（五）分析前因素对酶活性测定的干扰1、溶血2、抗凝剂3、标本的储存温度第五十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（六）酶活性浓度的单位1、酶活性单位（1）惯用单位（2）国际单位

定义：在特定的条件下，一分钟内使底物转变1μmol的酶量为一个国际单位，以IU表示。1IU=1μmol/min第五十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（六）酶活性浓度的单位（3）Katal单位：

定义：在规定条件下，每秒内催化转化

1mol底物的酶量。1Katal=1mol/s

Katal是我国法定的酶活性单位，常用单位一般为μKatal或nKatal。

1Katal=60×106UIU=1μmol/min=16.67nmol/s=16.67nKatal第五十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（六）酶活性浓度的单位2、酶活性浓度单位（临床上，酶活性浓度以每单位体积所含的酶活性单位数表示）（1）表示方法：目前我国各级临床中表示酶浓度的方法是U/L。

1U/L=16.67nKatal/L

第五十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（六）酶活性浓度的单位2、酶活性浓度单位的计算

U/L=×

△AV×106minε×V×L说明：V：反应体系体积（ml）

ε：摩尔吸光系数（cm2/mol）

v：样品量（ml）L：比色杯光径（cm)

△A：吸光度变化106：将mol换算成μmol摩尔吸光系数的定义为：在特定的条件下，一定波长的光，光径为1.00cm时，通过所含吸光物质的浓度为1.00mol/L的吸光度第五十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（六）酶活性浓度的单位3、参考区间和正常上限的倍数应用（1）参考区间第五十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第五十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（六）酶活性浓度的单位3、参考区间和正常上限的倍数应用（2）正常上限倍数的应用正常上限（upperlimitsofnormal,ULN）第五十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（七）系数K值的计算与应用1、K：酶活性浓度定量系数，主要用于临床酶活性测定的计算与校准。

U/L=×KK=例：NADH的ε为6.22×103cm/mol，血清量50μm，底物溶液为1ml。比色杯光径为1cm，则K=1.05×106/（6.22×103×0.05×1）=3376△AminV×106ε×V×L第五十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（七）系数K值的计算与应用2、K的意义与设置

K的设置应该考虑测定酶的参考范围上限及测定的时间两个方面。过高：测定的线性范围宽，但是重复性差

过低：线性范围窄，但是精密度好第六十页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（八）临床酶学测定的标准化1、标准化途径（1）使用推荐方法和参考方法（2）使用公认的酶校准物或酶参考物第六十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术（八）临床酶学测定的标准化2、酶活性浓度测定的参考系统（1）建立原级参考方法（2）制备原级参考物（3）建立参考实验室网络第六十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术二、酶质量测定（一）免疫化学法测定酶质量的原理1、放射免疫测定（RIA）将放射性核素标记的酶分子与相应的抗体作用产生沉淀，再将沉淀分离进行定量测定。例：用RIA检测尿中五项蛋白：β2-MG、IgG、Alb、THP、α1-MG诊断早起肾病。第六十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术二、酶质量测定（一）免疫化学法测定酶质量的原理2、其它方法：

（1）免疫抑制法常用于同工酶的测定。例如：CK-M抗体检测CK-MB的活性。第六十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术二、酶质量测定（一）免疫化学法测定酶质量的原理2、其它方法：（2）化学发光免疫测定（CLIA）将高灵敏度的化学发光测定技术与免疫法相结合的一项技术。第六十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术二、酶质量测定（一）免疫化学法测定酶质量的原理2、其它方法：（3）酶免疫测定（EIA）将酶催化作用的高效性与抗原抗体反应的特异性结合的一种微量分析技术。酶联免疫吸附实验（ELISA）酶免疫组化技术第六十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术二、酶质量测定（一）免疫化学法测定酶质量的原理2、其它方法：（4）荧光免疫测定（FEIA）是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪技术相结合的测定方法。标记物：荧光素第六十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术二、酶质量测定（二）酶质量免疫化学测定法的优点1、灵敏度高2、特异性高3、能用于测定一些无活性的酶蛋白4、应用于同工酶的测定第六十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术二、酶质量测定（三）免疫化学测定法的局限性1、制备足够量的提纯酶做为抗原或制备具有免疫化学性质的抗血清比较困难。2、测定繁琐3、测定成本高第六十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术三、同工酶的检测第七十页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术三、同工酶的检测（一）电泳法1、常用方法：醋酸纤维薄膜电泳（CAE）、琼脂糖凝胶电泳（AGE），聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等。第七十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术三、同工酶的检测2、例：LD琼脂糖电泳（1）电泳（2）染色（3）洗脱背景色（4）扫描区带（或将区带切下比色测定）电泳结果是从正极向负极顺序：LD1，LD2，LD3，LD4，LD5第七十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术三、同工酶的检测第七十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术三、同工酶的检测3、巨分子酶对电泳分析同工酶的影响（1）酶与免疫球蛋白形成复合物（2）酶与其它蛋白形成复合物（3）酶亚基与酶分子之间形成的聚合物第七十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术第七十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第二节酶测定技术三、同工酶的检测（二）层析法（三）免疫分析法（四）同工酶的其它分析方法第七十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第三节常用酶及同工酶测定的临床应用

一、血清酶（一）、血清酶的来源与去路1、血清酶的种类分类依据：酶的来源以及在血浆中发挥催化功能的情况。（1）血浆特异酶：在血浆中发挥特定的催化作用的酶（血浆固有酶）来源：肝脏第七十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第三节常用酶及同工酶测定的临床应用（一）、血清酶的来源与去路1、血清酶的种类分类依据：酶的来源以及在血浆中发挥催化功能的情况。（2）非血浆特异性酶：在血浆中很少发挥作用。外分泌酶：来源于消化腺或其它外分泌腺的酶。细胞酶：存在于各组织细胞中进行代谢的酶类。第七十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第三节常用酶及同工酶测定的临床应用（一）、血清酶的来源与去路2、血清酶的去路

血清酶的半衰期是指酶失活至原来活性一半时所需要的时间。一般以半衰期代表酶从血液中清除的快慢。第七十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第八十页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第三节常用酶及同工酶测定的临床应用（二）血清酶的生理差异1、性别

CK，ALP及γ-GT等有性别差异，男性略高于女性。2、年龄新生儿略高于成人实例：ALP1~5岁增至成人的2~3倍

10~15岁可达成人的3~5倍

20岁降至成人水平第八十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第三节常用酶及同工酶测定的临床应用（二）血清酶的生理差异3、进食在高脂、高糖饮食后血清中ALP活性增高。酗酒可使血清γ-GT升高第八十二页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第三节常用酶及同工酶测定的临床应用（二）血清酶的生理差异4、运动激烈的肌肉运动可使血清中多种酶如CK、

LD、AST、ALD和ALT等活性升高，其升高的幅度与运动量、运动时间、运动频率及骨骼肌所含的酶量有关。第八十三页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第三节常用酶及同工酶测定的临床应用（二）血清酶的生理差异5、妊娠妊娠期，胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，比如：ALP,LD,LAP,ALT等，引起血清中这些酶升高。6、其它血清中有些酶有种族差异。

第八十四页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第三节常用酶及同工酶测定的临床应用（三）血清酶的临床应用第八十五页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第八十六页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第三节常用酶及同工酶测定的临床应用二、尿液酶目前了解较多的尿液酶：AMS、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）白细胞酯酶

溶菌酶（LZM）、丙氨酸氨基肽酶（APP）β-葡萄糖苷酸酶（GRS）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）

LD、ALP、γ-GT

第八十七页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第三节常用酶及同工酶测定的临床应用1、AMS-尿液淀粉酶（1）来源：唾液腺或胰腺（2）种类：S型（唾液腺型）和P型（胰腺型）（3）用途：急性胰腺炎和急性腮腺炎（4）干扰因素

a、诊断胰腺炎的时候，应排除肾病和巨淀粉酶血症.b、尿液淀粉酶的活性影响因素：酸尿、草酸盐、柠檬酸盐可抑制该酶活性；磺胺类药物、止痛药可使该酶活性增高。

c、急性阑尾炎、肠梗阻、胰腺癌等可使AMS升高。

第八十八页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第三节常用酶及同工酶测定的临床应用二、尿液酶（二）NAG：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶1、来源：肾近曲小管上皮细胞2、用途（1）各种肾实质早期损伤的敏感标志物（2）糖尿病性肾病早期发现和病程监测的重要项目（3）反映肾病综合症、肾小球肾炎、高血压肾病和视网膜病的发展。（4）用于药物治疗时毒性反应，肾重金属毒害、肾移植排异监测等。第八十九页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第三节常用酶及同工酶测定的临床应用三、浆膜腔积液酶浆膜腔：人体的胸腔、腹腔和心包腔、关节腔的统称。浆膜腔积液：病理状态下浆膜腔内大量的液体潴留。第九十页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第三节常用酶及同工酶测定的临床应用三、浆膜腔积液酶（一）腹水：腹腔内的过多积液1、腹水中的主要酶：LD和ADA等2、临床意义（1）结核性渗出液：ADA升高（2）恶性腹水：ADA偏低（3）胰腺炎或胰腺创伤：AMS增高

第九十一页，共九十九页，编辑于2023年，星期二第三节常用酶及同工酶测定的临床应用三、浆膜腔积液酶（二）胸腔积液1、分类（1）漏出液：代偿性心力衰竭（2）渗出液：肺炎、恶性肿瘤或肺栓塞2、临床意义：（1）LD﹤200U/L为漏出液,LD﹥200