蛋白质一级结构的测定

蛋白质一级结构的测定魏涛当前第1页\共有24页\编于星期六\10点蛋白质的一级结构指：蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置。组成一个蛋白质分子的多肽链的数目和多肽链中氨基酸的精确序列是蛋白质一级结构的两个重要方面。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。一级结构(PrimaryStructure)当前第2页\共有24页\编于星期六\10点包括以下几方面内容：①多肽链的数目；②每条多肽链中氨基酸的种类、残基数目和排列次序；③链内或链间二硫键的位置和数目。当前第3页\共有24页\编于星期六\10点蛋白质一级结构测定的策略从蛋白质开始的蛋白质序列分析从DNA开始推蛋白质氨基酸序列质谱法测定蛋白质的一级结构当前第4页\共有24页\编于星期六\10点从蛋白质开始的蛋白质序列分析测定的基本战略测定一级结构的准备工作测定一级结构的基本步骤当前第5页\共有24页\编于星期六\10点测定的基本策略用两种裂解肽链的方法,分别得到裂解肽段；分离提纯肽段,测出各个肽段的氨基酸序列；对两套肽段序列比较,找出重叠肽,确定各肽段位置,拼凑整个肽链的氨基酸排序。当前第6页\共有24页\编于星期六\10点测定一级结构的准备工作对样品纯度的要求>97%

对蛋白质分子量的测定误差10%

测定分子中多肽链的数目与种类蛋白质的氨基酸组成蛋白质的配基蛋白质的端基分析当前第7页\共有24页\编于星期六\10点测定一级结构的基本步骤测定蛋白质分子中多肽链的数目拆分蛋白质分子中的多肽链测定多肽链的氨基酸组成分析多肽链的N末端和C末端断裂多肽链内的二硫键多肽链断裂成肽段测定各个多肽段的氨基酸顺序确定肽段在多肽链中的次序确定原多肽链中二硫键的位置当前第8页\共有24页\编于星期六\10点测得相对分子质量Mr

很多方法可用于确定蛋白质的相对分子量，如：渗透压、扩散系数、沉降系数凝胶过滤、凝胶电泳等，测定末端氨基酸数xX÷(m/Mr)=n(蛋白质分子中肽链数目)（m为样品质量）蛋白质中多肽链数目的确定当前第9页\共有24页\编于星期六\10点蛋白质中多肽链的拆分变性：8mol/L尿素或6mol/LHCI，或高浓度盐溶液如有二硫键交联：巯基乙醇，或过氧乙酸处理凝胶过滤或电泳分离不同肽链当前第10页\共有24页\编于星期六\10点多肽链的拆分当前第11页\共有24页\编于星期六\10点氨基酸组成分析酸水解：碱水解：甲基磺酸水解：优点：不破坏色氨酸，经碱中和后可直接上机自动分析缺点：不能有碳水化合物存在中和点不易掌握计算出各种氨基酸分子比多肽链分子量确定氨基酸组成当前第12页\共有24页\编于星期六\10点末端氨基酸分析N末端氨基酸分析丹黄酰氯法(DNS)：优点：可直接层析或电泳分离，荧光检测定性定量；灵敏度高(较二硝基氟苯法高100倍)

二硝基氟苯(DNFBorFDNB)法；氨肽酶法；当前第13页\共有24页\编于星期六\10点多肽—OC—CH—NH2+R+HCI弱碱性+DNS-氨基酸酸水解游离氨基酸有机溶剂萃取溶于水定量

+定性确定N末端氨基酸确定肽链数目多肽—OC—CH—NH—RDNS-氨基酸当前第14页\共有24页\编于星期六\10点将肽链裂解成小片断

要求：断裂点较少，专一性较强、产率高酶裂解法：常用的酶：胰蛋白酶：仅断裂Lys、Arg羧基形成的肽键（但）糜蛋白酶：位点：Tyr、Phe、Trp羧基肽键胃蛋白酶：位点：两种疏水性氨基酸形成的肽键嗜热菌蛋白酶：专一性较差金黄色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）：梭状芽孢杆菌蛋白酶（Arg蛋白酶）：化学裂解法：溴化氰法：专一性断裂蛋氨酸羧基形成的肽键当前第15页\共有24页\编于星期六\10点可得到合适大小的肽片断当前第16页\共有24页\编于星期六\10点Cyanogenbromide(溴化氰法）当前第17页\共有24页\编于星期六\10点肽段氨基酸序列的测定Edman降解法：一次可连续测定60~70个氨基酸；程序复杂，工作量大；酶降解法：质谱法：当前第18页\共有24页\编于星期六\10点Edman降解法测定N-末端氨基酸EdmanreagentPTC-多肽少一个N-末端氨基酸的肽链层析色谱鉴定重复①②③与DNS法联合①②③当前第19页\共有24页\编于星期六\10点肽片断在多肽链中排列次序的确定(见p179)当前第20页\共有24页\编于星期六\10点多肽链中二硫键位置的确定当前第21页\共有24页\编于星期六\10点多肽链氨基酸系列的直接测定：最初于1954年由英国剑桥大学的Sanger实验室建立；现主要由编码蛋白质的基因的核苷酸顺序推导.蛋白质序列数据库美国生物医学基金会的PIR(ProteinInformationResourceorProteinIdentificationResource);美国政府的GenBank(GeneSequenceDataBank)欧洲的EMBL(EuropeanMolecularBiologyLaboratoryDataBank)（欧洲分子生物学实验室数据库）