蛋白质结构分析技术

第一节蛋白质和多肽的

氨基酸序列分析Synopsis:

1.Apracticalapproachtodeterminingaminoacidsequencerequiresamethodtoremoveoneaminoacidatatimefromapolypeptidechain.2.Thisisachievedbytheuseofphenylisothiocyanate（异硫氰酸苯酯）astheN-terminallabellingreagent,theEdmanmethod.3.Thistechniquecanonlydealwithchainsof20to60aminoacids,andmostproteinsaremuchlarger.4.Tocompletetheprocess,selectivehydrolysisofthepolypeptidechaincutsverylongpolypeptidesintospecificfragmentsofmoremanageablesize.当前第1页\共有47页\编于星期六\11点N端序列分析Sangerwasthefirstpersontodetermineaproteinsequence,forinsulinin1953.Theproblem:afterlabellingtheN-terminalaminoacid,thepolypeptidechainmustbehydrolysedtoisolateandidentifythelabelledaminoacid.What'sneededisawaytoremovethefirstaminoacidwithouthavingtohydrolyzethewholechain.ThiswassolvedbyPerEdman,inSwedenin1956,byusingthereagentphenylisothiocyanatetolabeltheN-terminalendofthepolypeptidesample.当前第2页\共有47页\编于星期六\11点ItworksbycleavingtheN-terminalAAoffandleavingtherestofthepeptideintact.TheEdmanmethodcanberepeatedonthepeptideremainingafterthereaction,sothisisaveryeffectivemethodforobtainingAAsequenceinformation.InfactthewholesequenceofapeptidecontainingmanyAAscanbedeterminedbyEdmanmethod.当前第3页\共有47页\编于星期六\11点降解反应分三步偶联PITC的异硫氰酸酯基与蛋白的自由－氨基作用，产生苯氨基硫甲酰蛋白质。裂解PTC－蛋白质在无水条件下酸裂解，切下反应的那个残基，暴露出下一个自由－氨基。转化ATZ－氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液条件下，转化成稳定的PTH－氨基酸。PTH－氨基酸的鉴定薄层层析，HPLC,GC(气相色谱），质谱分析等。当前第4页\共有47页\编于星期六\11点当前第5页\共有47页\编于星期六\11点当前第6页\共有47页\编于星期六\11点蛋白质N端测序仪器分析法：1.液相旋转杯序列仪最早，很少用2.固相序列分析仪有些氨基酸不能正确测定3.气相顺序仪灵敏度很高，降低费用4.新型蛋白测序仪快速可靠，高自动化当前第7页\共有47页\编于星期六\11点二.C端序列分析适用1.鉴定重组蛋白是否正确表达2.大规模生产时质量控制3.N端封闭蛋白的分析4.DNA探针的设计原理化学试剂与蛋白质和多肽的羧基反应，反应后的C末端衍生物被切割下来，通过HPLC系统进行分析。当前第8页\共有47页\编于星期六\11点步骤活化酰胺化保护侧链羧基烷基化修饰Thr和Ser的羟基裂解和衍生当前第9页\共有47页\编于星期六\11点Protein-COOHProtein-TH1timeAlkylationCleavageCyclizationProtein-ATHReleasedATH-AA当前第10页\共有47页\编于星期六\11点第二节生物质谱技术MassSpectrometry(MS)是带电原子，分子或分子碎片按质荷比(m/z)的大小顺序排列的图谱。软电离技术：离子化过程中不会破坏分子结构电喷雾电离（ESI)(Fennetal.1989)

基质辅助激光解析电离（MALDI)(KarasandHillenkamp,1998)质谱仪组成：离子源，质量分析器，检测器当前第11页\共有47页\编于星期六\11点MALDI–MS

电离基本原理：将分析物分散在基质分子中并形成晶体。激光照射晶体时，使基质晶体升华，基质和分析物膨胀并进入气相。TheMALDIinstrumentisamatrixassistedlaserdesorptionionisation-time-of-flight（TOF)massspectrometer，specificallyforhighthroughputmassmappingofpeptidedigestfragmentsoriginatingfromproteinsexcisedfrom2D-teomics.

当前第12页\共有47页\编于星期六\11点MALDI离子源

电离技术的关键----基质的使用基质的作用：样品离子形成过程中充当质子化或去质子化试剂，使样品分子带上正电荷或负电荷。常用基质：

SA(芥子酸）

DHB(龙胆酸）

CCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸）当前第13页\共有47页\编于星期六\11点2.质量检测器

1）线性分析时间检测器（TOF)

优点：质量分析范围100Da~100kDa

不足：分辨率和测量准确度低

2）反射分析时间检测器（RETOF)

分析质量数10kDa以下的离子3.样品制备

当前第14页\共有47页\编于星期六\11点当前第15页\共有47页\编于星期六\11点二.

ESI–MS电离方法：靠强的电场使分子电离。分析物溶液流经一个细细的进样针，针头上加高电压用来产生正离子。高电压导致样品液流分散为呈喷雾状的带电荷的微小滴。当液滴从针尖通往入口时，在定向惰性气体流作用下，溶剂蒸发，液滴缩小，电荷密度增加，最终液滴爆裂，离子从液相中释放出来进入气相。ESI–MS优势：可与多种分离技术联合使用，如LC–MS,HPLC–MS等。当前第16页\共有47页\编于星期六\11点Itisoperatedwithelectrosprayionisationandsamplescanbeintroducedintothemassspectrometerbyanumberofdifferenttechniques.当前第17页\共有47页\编于星期六\11点TheQ-Tofisatandemmassspectrometer(MS/MS)withtwoanalysers。Thefirstbeingaquadrupoleanalyserthesecondanalyserisareflectrontime-of-flightanalyser

InMS/MSmode,thetwoanalysersareusedtogetherforstructuralstudiesbymonitoringfragmentationpatternsinmolecules.

当前第18页\共有47页\编于星期六\11点TheTSQ7000isatandemquadrupolemassspectrometerequippedwithelecgtrosprayandnanosprayionisation.TheTSQ7000hasarangeofMS/MScapabilities:precursorionscanning,productionscanningandconstantneutrallossscanning,whichmaketheinstrumentidealforthestructuralcharacterisationofawiderangeofbio-andorganicmolecules,andisparticularlyusefulforidentifyingpost-translationalmodifications.当前第19页\共有47页\编于星期六\11点分子量测定肽谱测定多肽和蛋白质序列测定巯基和二硫键定位蛋白质翻译后修饰蛋白质复合体分析蛋白质组研究应用当前第20页\共有47页\编于星期六\11点Horseheartmyoglobincanbeanalysedeitherwiththehaemmoleculeattachedtotheproteinbynon-covalentinteractionsusingneutralaqueousconditions,orinthedenaturedstate(withoutthehaemmolecule)usingacidifiedorganicsolvents.Underneutralconditions(uppertrace)theproteinremainsfoldedandsohasonly8or9siteswhichareexposedforionisation;alsothehaemligandremainsboundandthemassmeasuredis17,564.9Da.Underdenaturingconditions(lowertrace)theproteinismuchmorehighlycharged(n=9to28)duetothehighernumberofsitesexposedintheunfoldedstate,andasthehaemligandisnolongerboundthemassmeasuredis16,951.6Da.当前第21页\共有47页\编于星期六\11点MonitoringthemodificationofaClassIaldolase(MW37979.3Da)(lowertrace)wasachievedbyESI-MS.Themodificationinvolvedthecovalentadditionofdihydroxyacetonephosphate,thusincreasingthemolecularweightto38,134.3Da(uppertrace).当前第22页\共有47页\编于星期六\11点当前第23页\共有47页\编于星期六\11点第三节X射线晶体衍射技术X–raydiffractionmethod

使用X射线作为物理工具，间接地研究蛋白质晶体的空间结构。X–raydiffractiontechniquesgiveinformationaboutthestructureofsolids,thatis,thearrangementoftheatomsthatcomposethesolid.当前第24页\共有47页\编于星期六\11点X射线晶体衍射的基本原理当前第25页\共有47页\编于星期六\11点

利用X射线晶体衍射法测定蛋白质分子的构象，结果比较可靠。但是，与溶液中的构象相比，蛋白质分子在晶体中的构象是静态的。所以，利用蛋白质晶体不能测定不稳定的过渡态的构象。而且，很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶。另外，X射线晶体衍射的工作流程较长。当前第26页\共有47页\编于星期六\11点蛋白质X射线晶体结构测定的基本过程：经基因克隆，表达后生成的蛋白质提纯；晶体生长并经冷冻处理；重原子衍生物制备；衍射数据收集；衍射数据分析和改进；获得最后的结构模型（包括修正）。当前第27页\共有47页\编于星期六\11点ProcedureGrowCrystalCollectdiffractionpatterns--intensitiesonlyNativeHeavyatomderivativesCalculatephasesCalculateelectrondensitymapFitatomsintoeletrondensitymapRefinestructure--modifyatomicmodeluntilitfitsdiffractionpatterns当前第28页\共有47页\编于星期六\11点

1.对原材料的要求应具有高度均一性

2.晶体生长的生化，物理条件

pH值，离子强度，温度等

3.技术和方法分批静置法(batchmethod)

悬滴法(hangingdrop)4.蛋白质晶体的鉴定一.蛋白质结晶和晶体生长Crystallization当前第29页\共有47页\编于星期六\11点1.晶体的收集和处理2.X射线源的选择阳极靶式同步加速器辐射3.衍射线记录装置照相底片或图像板（对X射线敏感）计数管或面探测器4.衍射数据收集的全自动化二.衍射数据收集

Datacollection当前第30页\共有47页\编于星期六\11点1.数据的统一和还原2.同晶置换法

single/multipleisomorphousreplacement(SIR/MIR)3.分子置换法

Molecularreplacement(MR)4.多波长反常散射法Anomalousscatteringandmultiplewavelengthanomalousdispersion（MAD）5.差值电子密度法三.确定位相Phasing－核心问题当前第31页\共有47页\编于星期六\11点1.电子密度修饰2.分辨率3.分析电子密度图4.全自动化程序发展

四.电子密度图诠释Mapinterpretation当前第32页\共有47页\编于星期六\11点1.R因子2.限制性最小二乘修正3.全自动化软件4.结构模型表达五.结构模型精化Refinement当前第33页\共有47页\编于星期六\11点Resolution--Higherresolutionallowsmoreaccuratepositioningofatoms当前第34页\共有47页\编于星期六\11点第四节核磁共振波谱技术Nuclearmagneticresonance(NMR)

核磁共振是研究处在静磁场中的原子核与电磁波相互作用的学科。

NMR技术是目前唯一能够用以测定蛋白质溶液三维结构的方法。当前第35页\共有47页\编于星期六\11点NMR测定蛋白质三维结构的基本过程当前第36页\共有47页\编于星期六\11点

核磁共振是指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeemansplitting)，共振吸收某一特定频率的射频（radiofrequency,RF）辐射的物理过程。近年来，NMR法测定小蛋白的三维结构得到了成功的应用。NMR法不需要制备蛋白质晶体，但这种方法仅限于分析长度不超过150个氨基酸残基的小蛋白。当前第37页\共有47页\编于星期六\11点应用方面：2D和3D－NMR方法已提供相当数量的小蛋白质，寡核苷酸，寡糖的三维结构。提供有关局部结构，构象动力学的信息。用来表征电荷状态，构象，与配体结合的解离速度，研究蛋白质卷曲与折叠。鉴定蛋白质分子中某些原子与配体分子中某些原子的相互接触，研究大分子之间以及它们与小分子之间相互作用和分子识别。当前第38页\共有47页\编于星期六\11点由NMR数据决定蛋白质结构的过程：

研究样品的选择与制备；

NMR数据的采集与数据处理；质子自旋系统的识别与信号归属；决定结构约束因子和分析规则二级结构；计算出符合约束因子的三维结构和进行结构精修。当前第39页\共有47页\编于星期六\11点第五节溶液中蛋白质分子构象的研究方法一.紫外吸收法二.荧光光谱法三.圆二色性当前第40页\共有47页\编于星期六\11点第六节蛋白质组学Proteome一词由MarcWilkins于1994年在ItalySiena的一次2-DE电泳会议上首次提出的。Proteome,源于PROTEin与genOME的杂合，1995年文献中首次公开使用该词。Pr