蛋白质表达和抗体制备

蛋白质表达和抗体制备第一页，共二十八页，编辑于2023年，星期一常用蛋白表达系统(host)

原核：大肠杆菌。真核：酵母、昆虫、哺乳动物、植物。第二页，共二十八页，编辑于2023年，星期一大肠杆菌表达系统大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解；②商品化的载体和菌株种类非常齐全；③表达效率高；④易培养，成本低。缺点：①因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体；②蛋白质不能糖基化；③其内毒素很难除去。

第三页，共二十八页，编辑于2023年，星期一酵母表达系统优越性：①蛋白可糖基化，有相对正确的天然结构，可很好的生产分泌型蛋白；②表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中，实现高效率表达；③表达载体都为E.coli/PichiaPastoris的穿梭载体，可在获得克隆后采用E.coli细胞大量扩增。④易培养，成本低,可高密度发酵。缺点：①糖基化与哺乳动物有所差别；②培养上清多糖浓度高，不利于纯化。第四页，共二十八页，编辑于2023年，星期一昆虫细胞表达系统利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。优越性：①重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配；②可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体；③可进行分泌表达。缺点：①糖基化与哺乳动物有所差别；②表达量有限；③作为药物宿主细胞未被FDA认可；

④培养成本高。第五页，共二十八页，编辑于2023年，星期一哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。优越性：①糖基化与人源蛋白一致；②能表达天然结构的完整蛋白，活性很高；③可进行分泌表达。缺点：①表达量低；②培养成本很高，操作繁琐。第六页，共二十八页，编辑于2023年，星期一植物表达系统优越性：①能够表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质。②易于大规模培养和生产。③在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势。缺点：不易提取与纯化第七页，共二十八页，编辑于2023年，星期一

FactorsinE.coli

proteinexpression

VectorStrainGrowthconditions第八页，共二十八页，编辑于2023年，星期一原核表达载体众多，常用的有pET(T7promoter)、pQE(T5promoter)、pGEX(GST融合表达)等。各载体适应的菌株也不尽相同pET(BL21(DE3))、pQE(M15,JM109)、pGEX(BL21)。对于我们来说，最常用和最需掌握的是pET表达系统表达载体(Vector)

第九页，共二十八页，编辑于2023年，星期一Expressionplasmidfeatures第十页，共二十八页，编辑于2023年，星期一Lacoperon第十一页，共二十八页，编辑于2023年，星期一Inductionofexpression第十二页，共二十八页，编辑于2023年，星期一原核表达宿主菌名称特征用途抗性DH5α带有recAendA突变的克隆菌株，由于DH5α具有deoR变异，可以作为较大质粒的宿主菌使用。常用的质粒抽提工程菌株,可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。无BL21lon和ompT蛋白酶缺陷型用于PGEX载体构建质粒的蛋白表达无BL21(DE3)lon和ompT蛋白酶缺陷型，含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7RNA聚合酶基因用于含有T7的pET系列载体构建质粒的蛋白表达无BL21(DE3)-RP在BL21(DE3)细胞的基础上，具有额外拷贝的argU和proL基因解决了表达富含AT的基因组蛋白密码子偏倚性问题氯霉素BL21(DE3)-RIL在BL21(DE3)细胞的基础上，具有额外拷贝的argU、ileY和leuWtRNA基因解决了表达富含AT的基因组蛋白密码子偏倚性问题氯霉素BL21(DE3)-plysS带有可以与pET共存的、编码T7溶菌酶（T7RNA聚合酶的天然抑制物）的质粒。pLysS菌株在被诱导前T7RNA聚合酶的基础表达被抑制，这样可以使表达会影响宿主细胞生长和活力的重组体在宿主中更稳定。带有pLacI质粒的宿主菌产生额外的抑制pETBlue和pTriEx载体基础表达的lac阻遏蛋白更严格的本底表达控制，适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。氯霉素BL21(DE3)-Rosetta-gami（Rosetta-gami）携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG）稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，又具有thioredoxinreductase(trxB)和glutathionereductase(gor)两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达补充7种稀有密码子，促进蛋白可溶性及表达活性卡那霉素、氯霉素、四环素Rosetta-Blue带有recAendAlacIq突变的克隆菌株,高蛋白表达,补充大肠杆菌缺乏的AGG,AGA,AUA,CUA,CCC,GGA六种稀有密码子对应的tRNA。补充稀有密码子，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平氯霉素第十三页，共二十八页，编辑于2023年，星期一所有B型菌株，B834，BL21，BLR，OrigamiB，Rosetta及Tuner都缺乏纯化过程中降解蛋白的lon蛋白酶及ompT

外膜蛋白酶。因此，目的蛋白在这些菌株中的稳定性要高于带有这些蛋白酶的菌株。BL21(DE3)是用得最多的表达菌AD494(DE3)和BL21trxB(DE3)具有trxB突变，而Origami(DE3)，OrigamiB(DE3)和Rosetta-gami(DE3)菌株带有trxB和gor双突变。拥有trxB和gor突变的菌株比单具

trxB突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高多数氨基酸有不只一个密码子，而不同的生物使用这61种密码子的偏好性不同。每种细胞里，tRNA种类和数量直接反映了其mRNA使用密码子的种类和数量的偏好性。当外源目的基因mRNA在E.coli里过表达，由于密码子偏爱性不同，会因为缺乏某种或某几种tRNA，直接导致翻译终止或错误。tRNA不足会造成翻译停顿，早期翻译停止，移码突变，和氨基酸错掺等问题。Rosetta菌株是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。经提高稀有tRNA水平，这些蛋白的表达会大幅度提高。第十四页，共二十八页，编辑于2023年，星期一

表达条件培养基抗生素诱导剂诱导温度诱导时机诱导时间第十五页，共二十八页，编辑于2023年，星期一载体对表达的影响pET32,BL21(DE3),表达蛋白:Trx-His6-EK-IFN(MW35KD)pET43,BL21(DE3),表达蛋白:Nus-His6-STag-EK-IFN(MW78KD)NIIIMIpspsMNISPU:UninducedcrudeextractI:CrudeextractafterinducedS:LysissupertanantP:Lysisprecipitation第十六页，共二十八页，编辑于2023年，星期一0.1mMIPTG,incubatefor16hat16℃0.1mMIPTG,incubatefor3hat37℃

NISP

NISP表达条件对表达的影响pET21,BL21(DE3)-RIL,表达的蛋白:His6-REIIBP(MW67KD)U:UninducedcrudeextractI:CrudeextractafterinducedS:LysissupertanantP:Lysisprecipitation第十七页，共二十八页，编辑于2023年，星期一

增加可溶性和折叠降低蛋白合成速率。温度。裂解缓冲液的性质。融合标签二硫键第十八页，共二十八页，编辑于2023年，星期一pET载体E.coli表达蛋白流程制备pET载体制备插入DNA将插入片段插入到pET载体上转化表达宿主菌诱导/优化表达目的蛋白放大实验纯化目的蛋白第十九页，共二十八页，编辑于2023年，星期一蛋白抗体制备

第二十页，共二十八页，编辑于2023年，星期一多克隆抗体：由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同抗原决定簇的抗体的混合物，即多克隆抗体。单克隆抗体：由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。第二十一页，共二十八页，编辑于2023年，星期一据文献及DNAstar软件分析，确定各蛋白最可能抗原区序列，PrimerPremier5.0软件设计引物，从基因组，扩增目的基因。克隆至pET28a载体上。转化至DH5a中，经PCR验证重组子。重组子质粒再转化至BL21(DE3)菌株中，进行小量诱导表达，确认最适条件后，进行大量诱导表达，提取大肠杆菌包涵体，溶菌酶处理，添加去垢剂，超声破碎后，溶于8MUrea中，经镍柱层析咪唑洗脱，过夜透析，无菌过滤后，免疫家兔，通过化学发光Western印迹确定多克隆抗血清的效价。第二十二页，共二十八页，编辑于2023年，星期一抗原基因构筑：通过设计的抗原序列aa的个数，加上载体上含组氨酸标签序列的42aa，计算是否达到抗体注射免疫家兔的要求（17-25kDa之间）第二十三页，共二十八页，编辑于2023年，星期一诱导表达靶蛋白：PCR验证基因产物是否插入载体。转化至DH5a中测序，再转化至BL21中小量诱导表达各蛋白。探索蛋白表达最合适的条件，如温度、诱导时间、IPTG浓度。0h2h4h6h第二十四页，共二十八页，编辑于2023年，星期一大量诱导表达，分离包涵体：过夜培养25ml菌液，在5：1的锥形瓶:培养基中按1：50比例加入过夜菌液，30-35℃，0.4mMIPTG，按上述优化条件大量诱导表达靶蛋白。5000g,15min,弃上清，加入Bindingbuffer(-Urea,20mMPBS(pH7.8),500mMNaCl)悬浮菌液。加入lysozyme（溶菌酶）至终浓度1mg/ml，室温放置30min。加入1%Triton-X-100，冰中放置10min。超声破碎120W，4s，间隔4s,5min。上清另存用于检测。用Bindingbuffer(-Urea)悬浮洗涤可溶性杂蛋白。上清另存用于检测。沉淀用Bindingbuffer(+8MUrea)悬浮。取少量上清检测。其于冻存用于纯化。control第二十五页，共二十八页，编辑于2023年，星期一靶蛋白纯化:0.45um滤器(whatman)去除细菌蛋白碎片，以利于进行组氨酸标签表达蛋白的镍柱层析纯化。对蛋白进行定量（牛血清白蛋白法）。第二十六页，共二十八页，编辑于2023年，星期一镍柱层析:层析柱（(Poly-PrepChromatographyColumn,BIORAD)中加入1.5ml50%Ni-NTAHisBindResin，自然沉降，无菌水冲洗，3mlbindingbuffer(+8MUrea)平衡。（流速10ml/h）6ml（至少3ml）bindingbuffer(+8mUrea)洗柱，4mlwashingbuffer((20mMPBS,pH6.0,500mMNaCl,8MUrea)洗柱。6ml10mM(bindingbuffer+),50mM,100mM,150mM,200mMbuffer依次洗柱，洗脱靶蛋白。5ml无菌水冲洗。3mlBindingbuffer(+8MUrea)平衡。保留2mlBindingbuffer