蛋白质构效关系和新型溶栓药物的设计与研制

蛋白质构效关系

和新型溶栓药物的设计与研制分子医学教育部重点实验室宋后燕2005-6-151蛋白质分子构效关系的研究遗传信息传递的中心法则基因转录反转录信息RNA蛋白质(表型)遗传信息决定蛋白质分子的结构和功能复制翻译2蛋白质分子结构的研究一级结构高级结构X射线晶体衍射分析多维核磁共振计算机模拟3蛋白质分子结构计算机模拟1.蛋白质分子结构的模型化：蛋白质分子结构的计算机化2.蛋白质分子结构的几何优化3.蛋白质分子结构构象分析4.蛋白质分子结构搜索5.蛋白质分子结构间相互作用(MolecularDocking)范德华作用静电作用弱非键相互作用疏水作用4计算机描述分子结构的表达方式碎片码线性码拓朴码蛋白质结构转换为计算机语言计算机作结构分析和处理(最简单、唯一的方式进行表达)5拓扑码利用图论知识分子结构数学图原子(CHON)：结点不同原子用不同颜色表结点化学键：图中的边(单键、双键、芳香键等不同键用不同颜色)6蛋白质分子结构模拟蛋白质分子结构的查询：如搜索分子力学计算分子动力学计算量子化学计算编码方式不足以表达蛋白质分子空间结构7连接表：分子中所有原子、

键及其空间关系提供信息原子信息：类型电荷坐标键信息：类型所连原子糖链金属离子其他特殊结构信息计算机工作站软件连接表(PDB数据库)(蛋白质分子三维结构图)8蛋白质分子模拟时常用算法1、分子力学方法(MolecularMechanics，MM)计算分子几何构型和能量原子设为大小不同橡皮球键设为长度弹簧蛋白质分子成为间谐振动力学模型Hook定律计算原子势能9能量函数计算：

一系列能量项的加和Etot＝Estr＋Ebend＋Etors＋Evdw＋Eelec＋……Etot

分子总能量Etors

两面角扭转能量Estr

键伸缩能量Evdw

范德华能量Ebend

键角扭转能量Eelec

静电能量102、分子动力学方法

(MolecularDynamics,MD)以分子力学为基础设定势能函数和力场按经典牛顿力学运动方程积分搜索蛋白质分子系统的运动和构型空间(基本设定：无限空间的平均＝系统整体的平均或构型空间的积分)常用积分算法：Verlet

积分Becman

算法Leap-Forq

算法11分子动力学方法用于：模拟多肽、蛋白质或低聚糖、寡糖的分子空间构型计算晶体(固相)或溶液中(液相)蛋白质分子空间构型12分子动力学用于构象搜索时：用势能函数的梯度ΔiF

表示Fi随机产生初速度以原子的初始坐标为起点计算t时刻时原子位置运动速度新构象给定时间内多次迭代分子的优势构象13力场和势函数必须对每个待模建分子赋予一定力场。分子能量和分子结构之间关系就是分子力场函数(势函数)。分子的能量看作分子内各原子的空间坐标的函数，即分子的能量随分子构型的变化而变化。分子力场函数由经验公式计算。143、量子力学方法

(QuantumMechanic，QM)设定下列3个近似，计算分子轨道3.1.非相对论的量子力学(薛定谔方程)3.2.玻尔－奥本海默近似，将核运动和电子运动分开考虑3.3.轨道近似原子轨道组合后表示分子轨道蛋白质分子中特殊结构(金属元素、糖、脂等)没有合适力场参数选用量子力学计算法进行优化反应过渡态极化状态特殊电子云量子力学方法计算量和代价很大15分子力场函数构成：1、键伸缩能(bond)2、键角弯曲能(bondangle)3、两面角扭曲能(dihedralangel)4、非键相互作用(nonbondedinteraction)5、交叉能量项16分子能量和构型函数：1、各种不同原子在不同成键状况下的物理参数，键长、键角和两面角等。2、这些参数来自实验或量子化学计算。17蛋白质分子间相互作用：1、成键作用2、非成键作用18表：蛋白质之间的4种非键相互作用(水溶液中)非键相互作用类型稳定化能(kJ·mol–1)1.氢键作用中性基团作用肽键作用8-128-122.静电作用吸引排斥

42-213.疏水作用4-84.范德华作用419非键作用：力场方法计算

成键作用：量子化学计算20蛋白质分子对接模建：低精密度构象搜索对搜索到的构象，用能量函数打分、分离、筛选对高分构象作结构优化、能量评价判定分子对接模拟图21蛋白分子对接：1、实时图形对接2、自动对接22实时图形对接：1、以对接的蛋白质分子晶体结构为基础2、计算结合部位各种表面性质(静电、氢键、疏水键分布)3、计算对接表面性质4、按互补匹配原则，对接到结合部位计算机工作站分子模拟软件分子对接容易模拟23自动对接：1、蛋白质表面结构计算和模拟(MS法)2、两分子蛋白质分子表面结构匹配(口袋、凹槽······)3、匹配取向和优化参考24实施例：1、葡激酶分子单体三维结构模拟2、2分子葡激酶分子与微小纤溶酶对接25蛋白质构效关系研究中

运用的理论和技术基础计算机分子结构和分子对接模拟晶体结构分析(固相结构)核磁共振(液相结构)分子动力学计算：生物传感器LC/MS、噬菌体展示26t-PA和新型t-PA27组织纤溶酶原激活剂

(tissue-typeplasminogenactivator,t-PA)

人体内专一水解纤溶酶原形成纤溶酶，激活纤溶系统。纤溶功能在清除血管内纤维蛋白，保持血液循环起重要作用。28Theroleoft-PAinfibrinolysist-PA

t-PA:PAIPAI-1PlasminogenPlasminPlasmin:Anti-plasmin2-APFibrin

FibrinogenFibrin

ThrombinFibrinDegradationProducts29t-PA分子结构30t-PA的指形区(F区)t-PA分子1-50位氨基酸与纤维结合蛋白分子的指形区结构同源性很高t-PA分子与纤维蛋白的作用不仅和F有关，和其他结构域也有相互作用部分水解t-PA分子的N端，破坏指形区，导致t-PA分子失去与纤维蛋白的结合能力编码指形区基因的表达产物也能竞争性的抑制t-PA与纤维蛋白的结合缺失指形区的t-PA(t-PAΔF)，仍具有与纤维蛋白亲和力，而且t-PAΔF激活纤溶酶原的速率仍受纤维蛋白加速

31t-PA分子结构32t-PA的表皮生长因子区(E区)t-PA分子的51～91位氨基酸与人表皮生长因子的同源性很高E区存在肝细胞膜受体识别的结构与肝细胞膜受体结合，从血液中消除t-PA缺失E区的t-PA，血液内半衰期延长33t-PA分子结构34t-PA的三角区K1

和K2个三角区()，氨基酸残基92～173，180～261组成。Kl

和K2

都与纤溶酶原分子、凝血酶原分子的三角区有同源性。K2

区是t-PA分子与纤维蛋白分子结合部位，比F更为重要。K2

特异的单抗与t-PA结合后，t-PA失去了与纤维蛋白结合的能力；含完整的K2

的t-PA酶解片段，对纤维蛋白的亲和力。35t-PA分子结构36t-PA的轻链由276-527位氨基酸组成，与胰蛋白酶等丝氨酸蛋白酶有很高的同源性含有t-PA的活性中心，即His322、Asp371、Ser478轻链具有激活纤溶酶原的活力轻链特异的单抗特异地与t-PA的轻链结合，并抑制其活性轻链cDNA

表达产物，也有t-PA活性，t-PA水解纤溶酶原由轻链决定t-PA的活性受PAI抑制用DFP处理后的t-PA分子不能再和PAI结合

PAI和t-PA的结合位点：K296-R29937

t-PA作为基因工程溶栓药物的优缺点优点：非异源蛋白高效溶栓特异性催化血栓中纤溶酶原，溶解血栓中纤维蛋白缺点：

t1/2短4-6min

剂量大50-100mg

血管再栓塞(5-25%)

价格昂贵38t-PA分子结构改造的策略降低t-PA的血浆清除速率；增强纤维蛋白特异性；降低血浆抑制剂PAI对t-PA的抑制作用；增加t-PA分子稳定性39实现

t-PA改造的方法定点突变缺失突变融合蛋白401.Reteplase

t-PA缺失突变的产物缺失突变指形区，生长因子样区和

K1三角区含野生型t-PAK2三角区，轻链结构域15060例随机比较r-PA与rt-PA溶栓治疗

AMI(1997)30天内死亡率30天内脑卒中大出血颅内出血R-PA7.43%1.67%0.72%0.91%rt-PA7.22%1.83%0.82%0.88%NSNSNSNS(1)血浆半衰期延长2-20倍，溶栓效率提高3-5倍。(2)r-PA用大肠杆菌表达，廉价，试用方便，易于推广，产品已经上市，竞争力强。(3)不良反应与rt-PA比较无统计学上差别。41PrimaryStructureofr-PA422.TNK-tPA

野生型t-PA点突变产物(1)K1结构域替换一个氨基酸，形成一个新的糖基化位点。(2)K1结构域替换一个氨基酸，去除一个原有的糖基化位点。(3)轻链结构域中替换四个氨基酸。逃逸PAI-I的抑制作用。

TNK-tPA

rt-PA

血浆t1/2(min)173-4

纤维蛋白特异性＋＋＋＋体外溶栓速度＋＋＋体内溶栓速度＋＋＋

PAI-1抗性＋＋－再梗塞＋＋＋43PrimaryStructureofTNK-tPA44TNK-tPA

的不良反应

死亡率(%)非颅内大出血(%)颅内出血(%)

TNK-tPA6.2 4.7 0.9(n=8641)

rt-PA6.2 5.9 0.9(n=8488)

453.Lanoteplase(NPA)

野生型t-PA缺失突变体，去除了指形区，表皮生长因子区，并修饰了K1

三角区内的糖基化位点。由中国仓鼠卵巢细胞表达生产。

NPArt-PA

半衰期t1/2(min)373-4

冠脉再通率(％)5746

出血等不良反应＋＋＋NPA可一次性静脉用药464.AFA-UK－－导向溶栓药物纤维蛋白单抗Fab

片段单链UK(快速与血栓结合)(溶栓作用)血浆

t1/2

显著延长，溶栓效率比rt-PA和Scu-PA提高9倍。血浆t1/2(min)凝血时间

AFA-UK61.3正常

Scu-PA5.0延长

rt-PA4.3延长47导向溶栓药物针对不同的需要可以选择不同的单抗选用抗纤维蛋白单克隆抗体选用抗血小板膜受体

GPIIb/IIIa、GMP-140等的单克隆抗体针对富含凝血酶的新鲜血栓，则可选用抗凝血酶单抗作为导向载体48葡激酶和新型葡激酶49Crystalofr-Sak

50CrystalStructureofr-Sak

513DModelingStructureofmPlg

52MolecularDockingofSakandmPlg53DimerStructureofr-Sak

54ReducingSDS(A)andzymography(B)analysisofstoredwt-Sak55

HydrophobicSideofr-Sak56AllergicreactionofguineapigsafterimmunizedbySak

Groupsn＋

－

%wt-Sak201