基础医学第四章 DNA的生物合成

第四章DNABiosynthesisDNA的生物合成本章主要内容★

DNA复制的基本特性★

DNA复制的反应体系★

DNA复制过程★

DNA损伤、突变和修复★逆转录现象和逆转录酶DNARNAprotein复制转录翻译逆转录RNA复制3DNA是大多数生物的遗传物质的载体遗传分子生物学中心法则第一节

DNA复制的基本特性

BasicCharactersofDNAReplication复制(replication)

——指在生物体内以亲代DNA分子两条链为模板，合成两个子代DNA分子的过程DNA复制的基本特性

半保留复制

半不连续复制双向复制特定的复制起点需要引物一、半保留复制

(semiconservativereplication)DNA复制时，亲代DNA双螺旋解开成为两条单链，各自作为模板，按照碱基配对规律合成一条与模板相互补的新链，形成两个子代DNA分子。每一个子代DNA分子中都保留有一条来自亲代的链。这种DNA复制的方式称为半保留复制。含15N-DNA的细菌第一代细菌第二代细菌培养于普通培养基继续培养于普通培养基轻DNA沉降的位置重DNA沉降的位置中等密度DNA沉降的位置DNA半保留复制的实验证明TGCACGTDNA的半保留复制ACGTAGCTGCACGTACGTAGCTGCACGTACGTAGCTGCACGTACGTAGC二、DNA复制的方向和方式模板DNA的阅读方向是3’→5’新链的延伸方向是5’→3’PC3’5’ThedirectionofnewstrandPPPPPP3’5’GCTATTtemplatePGPAPTPAPAOH12MechanismofDNAreplicationDNA复制时碱基的配对规律：A=TG≡CDNA的复制泡及复制叉原核生物的DNA为环状，复制时要在特定的复制起始点上开始解链，形成“复制泡”，并向两个方向解链，形成两个复制叉。复制叉复制叉亲代的DNA复制叉的形成两个子代的DNA分子三、半不连续复制领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)

冈崎片段(Okazakifragment)

领头链随从链冈崎片段复制的保真性新链的延伸过程严格遵守碱基配对的规律，即A＝T，G≡CDNA聚合酶对碱基的选择能力，能选择与亲代模板链正确配对的碱基进入子链相应的位置

校读修正错配碱基，通过DNA聚合酶的3′→5′外切酶活性，在碱基发生错配时，及时切除并更换上正确碱基第二节

DNA复制的反应体系ReactionSystemforDNAReplicationDNA复制的反应体系组成有：①模板(template)，DNA的两条单链均作为模板②主要的复制酶，DNAdependentDNApolymeraseorDDDP,DNApol④引物(primer)，是一段短的特殊RNA③底物(substrate)，dNTP⑤其他的酶和蛋白质因子，包括拓朴异构酶、解螺旋酶、DNA单链结合蛋白、引物酶、DNA连接酶等一、DNA聚合酶DNAdependentDNApolymerase，DDDP，或DNApol功能：5’→3’聚合活性外切活性5’→3’外切活性3’→5’外切活性3’5’5’3’5’→3’外切活性3’5’5’3’3’5’5’3’3’→5’外切活性3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’(一)原核生物DNA聚合酶Ecoli中的DNA聚合酶，已知有三种，分别为DNApolI，DNApolII，DNApolIII5’→3’聚合活性外切活性5’→3’外切活性3’→5’外切活性切除引物校读作用DNA聚合酶I的校读作用3′5′3′5′DNApolI的3′→5′外切活性错配碱基AGAGCTTAAGCGTGCGGTATGTCTCGAATTCGCACGCCAC种类DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ分子组成单一多肽链不清10种亚基的不对称二聚体生物学活性（1）5′→3′聚合活性聚合活性低有聚合活性高（2）3′→5′外切酶活性有有有（3）5′→3′外切酶活性有无无功能①校读作用无其他酶时发挥作用①主要的复制酶②修复填补②校读作用E．coli中三种DNA聚合酶的比较DNApolⅢ的不对称异源二聚体结构γ复合物核心酶核心酶DNA聚合酶种类生物学功能DNA聚合酶α有引物酶活性，参与复制的引发过程DNA聚合酶β主要参与DNA的修复过程DNA聚合酶γ参与线粒体中DNA的复制DNA聚合酶δ是最主要的复制酶，参与链的延伸DNA聚合酶ε参与修复过程(二)真核生物DNA聚合酶二、DNA解螺旋酶、DNA拓扑异构酶、

单链DNA结合蛋白(一)DNA解螺旋酶(helicase)

每解开一对碱基，需消耗2分子ATP功能：使DNA双链解开成为单链现知为DnaB蛋白(二)DNA拓扑异构酶(topoisomerase)功能：使DNA超螺旋旋松，理顺超螺旋，便于DNA解链既能水解、又能连接磷酸二酯键特点：3233TopoisomeraseICutonlyonestrandofDNA,noATPneeded拓扑异构酶ITopoisomeraseII34CuttwostrandsofDNA,ATPneeded拓扑异构酶II

E.coli

的拓扑异构酶拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶Ⅱ亚型topoⅠDNAgyrase(topoⅡ)topoⅢtopoⅣ功能切断DNA双链中的一股，松弛后再封闭切断DNA的双股链，松弛后再封闭是否需要ATP不需要需要(三)DNA单链结合蛋白(DNAsinglestrandbindingprotein,DBPorSSB)功能：与解开的DNA单链结合，稳定并保护DNA单链

*防止单链重新形成双螺旋，保持模板的单链状态以便于复制*防止单链模板被核酸酶水解意义：三、引物酶和引发体(primase,primosome)引物酶，即DnaG蛋白，催化引物的生成引发体，由oriC，DnaA、DnaB、DnaC及DnaG组成

引物为一段短的RNA片段为什么需要引物？DNA聚合酶不能催化游离的dNTP聚合四、DNA连接酶(DNAligase)功能催化DNA分子中两段相邻单链片段的连接，但不能连接单独存在的DNA单链DNA连接酶催化的反应是耗能的，在真核生物中利用ATP供能，而在原核生物中则消NAD+DNA连接酶的作用真核生物原核生物第三节

DNA复制过程DNAReplicationProcess生物体在细胞分裂之前要完成DNA复制。DNA复制是一个连续酶促反应的复杂过程，大致分为复制的起始复制的延伸复制的终止

一、原核生物DNA复制的基本过程(一)复制的起始原核生物DNA复制起始以形成引发体(primosome)，催化引物(primer)的生成为标志。1.DNA拓扑异构酶松解超螺旋，解螺旋酶使DNA双链解开SSB3535DnaBDNA拓扑异构酶DnaADnaC

复制是在一个特定的起始点上开始，Ecoli的复制起始点oriC有特殊的碱基组成，四个9核苷酸组成的一致性序列TTATCCACA能被DnaA所识别及结合，在DanC的帮助下，解螺旋酶DnaB结合到该区，使DNA局部解链。GGATCCTGgnTATTAAAAAGAA[GATCTnTTTATTTAGAGATCTGTTnTATT101150200nTTtAAGATCAAnnnnnTggnAAGGATCncTAnCTGTGAATGATCGGTGA201250TtnAnCAgAGTTATCCAC]AntnGAnnGcnn-GATGTGATCTCTTATTAGGATCGnnntnnnnTGTGGATAAgnngGATCCnnTCCTGGnCCGTATAAGCTGGGATCAnAATGngGGnTTATACACAgCtCAAAAncgnACaaCGGTTaTTCTTTGGATAACTACCGGTTGATCCAAGCTT50151100151E.coli的oriC结构。剪头所示为四个9核苷酸序列，黑括弧内所示为245个碱基组成的最小复制起始区。GATC为BglII内切酶识别位点。SSB3535DnaBDNA拓扑异构酶引物酶DnaCDnaA含有解螺旋酶(DnaB)、DnaA、DnaC、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

2.引发体的组装及引物的形成3535引物酶在引发体引物酶的作用下，催化合成一段短的RNA作为引物

(二)复制的延伸当引物合成后，DNA聚合酶可在引物的3’-OH基础上逐步催化脱氧核苷酸的聚合，以3’-5’磷酸二酯键相连，使新链不断向前延伸。3535DNApolIII本质：

3’-5’磷酸二酯键的不断生成DNA复制的延伸过程领头链的合成(DNApolIII)DNA拓扑异构酶II(DNAgyrase)随从链的合成RNA引物RNA引物引物酶随从链的合成(DNApolIII)解螺旋酶复制叉的前进方向(三)复制的终止从一个亲代DNA分子到两个子代DNA分子的合成结束细菌的环状DNA从两个复制叉向前复制延伸，在同一个终止点上结束两个复制叉上的延伸速度可以是不同的E.coli的复制起始点在82位点，终止点在32位点E.Coli基因组结构复制起始点复制终止点82位点32位点

在复制的终止阶段，要切除引物，并填补引物切除后留下的空隙。对于E.coliDNA的复制，主要由DNApolI发挥这一作用。最后，由DNA连接酶将不连续的片段进行连接，从而成为完整的DNA分子。二、滚环复制一些简单的环状DNA如质粒、病毒DNA或F因子经接合作用转移DNA时，采用滚环复制(rollingcyclereplication)滚环复制时，亲代双链DNA的一条链在复制起点处被切开，5'端游离出来。DNApolⅢ可以将脱氧核苷酸聚合在3'-OH端。外环的5’-端不断向外侧伸展，作为模板指导另一条链的合成延伸DNA的滚环复制三、真核生物DNA复制的特点真核生物DNA复制也比原核生物的复制过程复杂得多，在细胞的S期完成DNA复制真核生物DNA复制为多点双向复制，有多个复制起始点，形成多个复制子真核生物的DNA复制与核小体装配同步进行真核生物的DNA末端有端粒结构，由端粒酶催化形成真核生物的DNA复制叉及其复制过程

真核生物DNA的多点双向复制

两个复制起始点之间的一段序列为一个复制单位，也称复制子四、端粒DNA及端粒酶由特殊DNA即短的GC丰富区重复序列(repeatsofshort,GC-richsequences)及蛋白质组成，覆盖在染色体两个末端的庞大结构，称为端粒端粒的概念对维持染色体DNA的稳定，防止DNA链的缩短有重要意义

端粒的功能端粒的特征序列端粒的重复序列有种属特异性，在四膜虫为TTGGGG/AACCCC；在脊椎动物包括人为TTAGGG/AATCCC

端粒酶(telomerase)是一种由RNA及蛋白质组成的复合酶以端粒酶中的RNA为模板，经逆转录而延伸末端的DNA

人的端粒酶(telomerase)组成端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

第四节

DNA损伤、突变和修复DNADamage(Mutation)andRepairDNA突变(DNAmutation)或基因突变是指DNA分子中有碱基的改变，也称DNA损伤(DNADamage)DNA碱基的改变可发在复制过程中，或在某些理化因素作用下引起DNA突变一、引起DNA损伤的因素1.物理因素，如紫外线，辐射等紫外线可使DNA分子中相邻的两个嘧啶碱基发生共价交联形成嘧啶二聚体Turnto672.化学因素

包括一些药物、化学试剂、食品添加剂、工业排出废物、汽车排放废气、某些农药等

亚硝酸盐或亚硝胺类可使碱基发生突变，如胞嘧啶脱氨突变为尿嘧啶氮芥类烷化剂能使碱基或核糖被烷基化

苯并比类使DNA中嘌呤碱基产生共价交联

Ames试验是一种回复突变试验，用于新化学品、药物遗传毒性的初筛利用组氨酸依赖性鼠沙门氏菌为检测菌株，受试物如有诱变性，可使回复突变菌落明显增加，并有剂量依赖性3.生物因素某些病毒或噬菌体的感染，可导致基因的突变，与某些肿瘤或癌症的发生密切相关乙肝病毒为噬肝细胞的部分双链DNA病毒，可整合至宿主染色体DNA，其整合及表达产物均可引起宿主细胞基因突变及表达失常乙肝病毒感染人群发生肝癌的危险度为非感染人群的100倍以上

二、基因突变类型1.点突变2.缺失、插入及框移突变3.重排DNA分子上的碱基发生错配称为点突变，包括碱基的转换、颠换包括多个碱基或一段核苷酸序列的缺失、插入，常导致翻译的读码框架改变，称框移突变DNA分子中的某个片段从一位置转到另一个位置，或不同DNA分子间DNA片段的转移及重新组合

三、DNA损伤的修复即通过细胞内一系列酶系统的作用，消除DNA分子上的突变部位，使其恢复正常结构主要类型光修复(lightrepair)切除修复(excisionrepair)重组修复(recombinationalrepair)SOS修复(SOSrepair)1.光修复(lightrepair)300～600nm范围内的光波可激活细胞内的光修复酶(photolyase)，该酶能特异地识别共价交联的嘧啶二聚体，断裂两个嘧啶环间形成的共价键，使二聚体解聚，恢复DNA原来的结构Goto612.切除修复(excisionrepair)

(1)碱基切除修复(baseexcisionrepair，BER)

切除修复可分为碱基切除修复和核苷酸切除修复等方式，其基本过程包括识别、切除、修补和连接指切除和替换由内源性化学物质作用产生的DNA碱基损伤，DNA糖基化酶(DNAglycosylase)参与此过程DNA碱基切除修复(2)核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair,NER)原核细胞中，由UvrA、UvrB和UvrC蛋白形成ABC切除核苷酸酶复合物，在损伤点5′端第8个磷酸二酯键和3′端第15个磷酸二酯键切除包括损伤部位在内的一段碱基，留下缺口由DNA聚合酶I和DNA连接酶来修补原核生物核苷酸的切除修复3.重组修复(recombinationalrepair)

当DNA分子损伤来不及修复完善时所采用的修复机制人类这种切除核苷酸酶活性由8～10个蛋白协同完成着色性干皮病基因(xereodermapigmentosumpomplementarygroup，XP)产物为XPA～XPG，ERCC系列有切除核苷酸酶活性XP产