第二章基因工程酶学基础

第二章基因工程的酶学基础当前第1页\共有97页\编于星期五\22点工具酶在生物技术中能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录及其它修饰等有关的各种酶系统称为工具酶。酶是DNA重组技术中必不可少的工具。当前第2页\共有97页\编于星期五\22点核酸水解酶类核酸合成酶类核酸修饰酶类核酸内切酶核酸外切酶DNA聚合酶DNA连接酶RNA聚合酶磷酸酶核苷酸转移酶核苷酸激酶甲基化酶当前第3页\共有97页\编于星期五\22点主要工具酶当前第4页\共有97页\编于星期五\22点当前第5页\共有97页\编于星期五\22点第一节限制性核酸内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶和反转录酶第四节DNA修饰酶当前第6页\共有97页\编于星期五\22点第一节限制性核酸内切酶核酸酶：核糖核酸酶RNase：脱氧核糖核酸酶DNase：核酸外切酶exonuclease：核酸内切酶endonuclease：通过切割两相邻核苷酸残基间的磷酸二酯键，使核酸分子的多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。专门水解断裂RNA分子特异水解断裂DNA分子

从核酸分子末端开始，一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段当前第7页\共有97页\编于星期五\22点限制性内切酶Restrictionenzymes(分子手术刀)在DNA上核苷酸的特定连接处以特定的方式把DNA双链打开。识别DNA上特定碱基组成的序列并在这些序列位点上切断DNA分子水解磷酸二酯键的一种内切核酸酶。当前第8页\共有97页\编于星期五\22点主要来源于原核生物自我保护作用功能来源据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》统计，仅Ⅱ型限制性核酸内切酶就已从各种不同的微生物中分离出了2300种以上，可识别230种不同的DNA序列。研究发现，细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，一起构成限制-修饰系统。当前第9页\共有97页\编于星期五\22点早在上世纪60年代Linn和Arber在研究噬菌体的寄主范围时发现如下的现象：分别在E.coli的K菌株和B菌株上生长的λ噬菌体（称λK和λ

B）能高效感染各自的宿主;但用λK感染B菌株或用λ

B去感染K菌株则感染率会大大降低，这就是限制。如果一旦λK感染B菌株成功则在B菌株中形成的后代也就能高效感染B菌株，再也没有限制现象，这个现象称为修饰。限制和修饰是由宿主控制的，故称为宿主控制的限制和修饰作用。限制-修饰系统当前第10页\共有97页\编于星期五\22点当前第11页\共有97页\编于星期五\22点限制限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。细菌自身的DNA碱基被甲基化酶修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。修饰Dam甲基化酶：GATC腺嘌呤N6位置引入甲基Dcm甲基化酶：CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置引入甲基当前第12页\共有97页\编于星期五\22点现已从各种微生物中发现与鉴定出3800余种限制-修饰系统，其中有限制性内切核酸酶3819个、甲基转移酶844个。现已商品化的限制酶624个，甲基转移酶32个。1.限制性内切核酸酶的类型Ⅰ型限制性内切酶（90个）

Ⅱ型限制性内切酶（3714个）

Ⅲ型限制性内切酶（12个）

当前第13页\共有97页\编于星期五\22点

I型限制性内切酶1968年首先由M.Meselson和R.Yuan在从大肠杆菌B株和K株分离（1）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列

EcoB：TGA(N)8TGCT

EcoK：AAC(N)6GTGC（2）切割位点在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链（3）作用条件需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）当前第14页\共有97页\编于星期五\22点首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离第一个酶是HindⅡ，其次是

HindIII。II类限制性内切酶（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）,与DNA的来源无关。（2）切割位点识别位点处切开双链DNA。形成粘性末端或平齐末端（3）粘性末端EcoRI5’-G

A

A

T

T

C-3’5’端凸出

3’-C

T

T

A

A

G-5’

EcoRV5’-G

A

T

A

T

C-3’

3’-C

T

A

T

A

G-5’PstI

5’-C

T

G

C

A

G-3’

3’-G

A

C

G

T

C-5’

3’端凸出

当前第15页\共有97页\编于星期五\22点III类限制性内切酶在完全肯定的位点切割DNA（一般在识别位点24-26bp），但反应需要ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸）。EcoP1:AGACC——EcoP15:CAGCAG——在基因工程操作中用途不大当前第16页\共有97页\编于星期五\22点当前第17页\共有97页\编于星期五\22点2.限制性内切核酸酶的命名1）用属名的第一个字母和种名的头两个字母，构成酶的基本名称。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。2）将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。如HindⅡ：d菌株EcoRI：抗药性R质粒3）如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。4）还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。如R.HindⅢ表示限制性内切酶M.HindⅢ表示相应的甲基化酶。实际应用中，R常被省略。（EcoRI、HindⅢ）当前第18页\共有97页\编于星期五\22点1）识别序列的特异性未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（4-6bp，多数是呈典型的旋转对称型的回文结构）。与DNA的来源无关，即没有种的特异性。3.Ⅱ型限制性内切酶的基本特性当前第19页\共有97页\编于星期五\22点稀有切割限制性内切核酸酶（rarecutter）可以识别6个以上的核苷酸序列的少数的限制内切酶。如Not

I

（GCGGCCGC）某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个碱基并非严格专一。如HindⅡ可识别不止一种核苷酸序列：

Y:C或TR:A或GGTYRAC-3’5’-HindⅡ可识别几种核苷酸序列？GTCGAC和GTTAAC当前第20页\共有97页\编于星期五\22点2）Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能Ⅱ型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。它们识别相同的DNA序列，但功能不同。如EcoRI限制性内切酶和EcoRI甲基化酶前者：5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’后者：5’-GAA*TTC-3’

3’-CTT*AAG-5作用的位点也不相同两者命名如何区分？功能有何不同？当前第21页\共有97页\编于星期五\22点3）切割位点的特异性形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易得多。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。粘性末端的意义①连接便利末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。②末端标记③补平成平齐末端当前第22页\共有97页\编于星期五\22点粘性末端与平齐末端连接的处理方法ⅰ）添补法：利用DNA聚合酶Ⅰ(klenowfragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。ⅱ）削除(平)法利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端当前第23页\共有97页\编于星期五\22点平齐末端的特点连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接效率的1%，这种连接常出现多联体连接。在识别序列的对称轴上同时切割EcoRV5’-G

A

T

A

T

C-3’

3’-C

T

A

T

A

G-5’当前第24页\共有97页\编于星期五\22点不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。识别位点和切点完全相同如HindⅢ

和HsuIHindⅢ

5’-A

A

G

C

T

T-3’3’-T

T

C

G

A

A-5’HsuI5’-A

A

G

C

T

T-3’3’-T

T

C

G

A

A-5’4.同切点酶（Isoschizomer)1）原型酶的同切点酶（同裂酶）：当前第25页\共有97页\编于星期五\22点识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。2）新裂酶：当前第26页\共有97页\编于星期五\22点识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、Bgl

Ⅱ、BclI、XhoⅡ等5’-G

G

A

T

C

C-3’3’-C

C

T

A

G

G-5’BamHIBclI5’-T

G

A

T

C

A-3’3’-A

C

T

A

G

T-5’5’-A

G

A

T

C

T-3’3’-T

C

T

A

G

A-5’BglⅡ5’-U

G

A

T

C

Y-3’3’-Y

C

T

A

G

U-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。5.同尾酶(Isocaudamers）基因工程载体构建过程常用的同尾酶有：BamHI/BglII,EcoRI/MunI,SalI/XhoI,XbaI/SpeI。当前第27页\共有97页\编于星期五\22点同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。5’-G3’-C

C

T

A

GG

A

T

C

T-3’A-5’BamHIBgl

Ⅱ5’-G

G

A

T

C

T-3’3’-C

C

T

A

G

A-5’5’-G

G

A

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C

C-3’3’-C

C

T

A

G

G-5’5’-A

G

A

T

C

T-3’3’-T

C

T

A

G

A-5’BamHIBgl

ⅡG

G

A

T

CCA

G

A

T

C

T当前第28页\共有97页\编于星期五\22点6、影响限制性内切酶活性的因素1）.DNA样品的纯度加大酶的用量，1ugDNA用10U酶扩大反应体积（>20l）延长保温时间添加阳离子亚精胺一般采取在DNA样品中若含有蛋白质，或没有去除干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和某些高浓度金属离子，均会降低限制酶的催化活性，甚至使限制酶不起作用。

DNA的浓度不宜过高，高浓度的DNA会使溶液的粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为50ul内含1ugDNA。当前第29页\共有97页\编于星期五\22点大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：2）DNA的甲基化程度DNA腺嘌呤甲基化酶（DNAadeninemethylas,dam)（修饰GATC中的A）；DNA胞嘧啶甲基化酶（DNAcytosineethylas,dcm)（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。哺乳动物的DNA通常在鸟嘌呤核苷残基的5'侧也发生甲基化。甲基化程度与DNA来源的细胞类型、环境等有密切的关系。可以根据各种同裂酶所具有的不同的甲基化的敏感性对真核基因组DNA的甲基化作用模式进行研究。例如，当CCGG序列中内部胞嘧啶残基被甲基化之后，MspI仍会将它切割，而HpaII(正常情况下能切割CCGG序列)对此类的甲基化作用则十分敏感。当前第30页\共有97页\编于星期五\22点不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。3）酶切反应的温度当前第31页\共有97页\编于星期五\22点4）DNA分子的构型构型：对超螺旋的质粒或病毒DNA酶切时，所需酶量大于线性状态。位点偏爱性：EcoRⅠ酶切割噬菌体中的5个位点时，近左端的位点比分子中间的位点切割快10倍。对只含识别序列不具催化活性：必须在两侧各延长一个或几个核苷酸。（设计引物带酶切位点必须考虑保护碱基）当前第32页\共有97页\编于星期五\22点当前第33页\共有97页\编于星期五\22点是影响限制酶活性的重要因素5）缓冲液(Buffer)缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/AcK

：提供Mg2+和离子强度Tris-HCl：维持pH,大多数为7-7.6二硫苏糖醇（DTT）：防止酶氧化,保持酶稳定性牛血清白蛋白（BSA）等：中性蛋白质,防止酶在低浓度的蛋白质溶液中变性商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液当前第34页\共有97页\编于星期五\22点如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。7、酶的星号活性特异性的限制性内切酶介导的DNA裂解，可以从这些酶的最适合的不同的反应条件下发生的松弛或改动的。其结果通常是在非规范的识别位点裂解，或有时完全丧失的特异性。在低盐、高pH（>8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：当前第35页\共有97页\编于星期五\22点诱发星（*）活性的原因酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件高浓度甘油AvaI、AvaⅡ、PstI、XbaI碱性PH值AviⅡ、MstI低离子强度ApeI低盐浓度

Bst707I低PH值PshBI其他二价离子代替mg2+(Mn,Cu,Co,Zn等)HindⅢ、SfiIβ-巯基乙醇+低离子强度AvaⅢ有机溶剂(DMSO、乙醇等)酶与底物DNA比例过高当前第36页\共有97页\编于星期五\22点当前第37页\共有97页\编于星期五\22点8、限制性内切酶对DNA的消化内切酶与识别序列的结合模式

1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。当前第38页\共有97页\编于星期五\22点1）DNA分子的单酶切环状DNA：完全酶切时，产生与识别序列数(n)相同的DNA片断数，且DNA片断的两末端相同；线性DNA：n+1片断数。EcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRI当前第39页\共有97页\编于星期五\22点2)DNA分子的双酶切消化在相同的缓冲液中反应同时进行若需要不同的缓冲液,采用3种方法ⅰ)先用要求低离子强度的酶切割（低盐酶）,再加NaCl调节离子强度,并用第二种酶切割（高盐酶）；ⅱ)先用最适反应温度较低的酶，升温后再加入第二种酶；ⅲ)反应体系相差大的，第一种酶切反应后回收，再切割。当前第40页\共有97页\编于星期五\22点当前第41页\共有97页\编于星期五\22点基因工程中一般使用双酶切？BamHIEcoRIEcoRIEcoRIBamHIBamHIEcoRIBamHI单酶切阳性克隆比例非常低；单酶切无方向性。当前第42页\共有97页\编于星期五\22点3）完全酶切消化与不完全酶切10kb1kb3kb6kbEcoRIEcoRI6kb3kb1kb10kb9kb1kb6kb4kb3kb完全酶切不完全酶切通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。当前第43页\共有97页\编于星期五\22点9、酶切反应的终止65℃保温20min，或70℃10min。加入终止反应液，多为电泳上样缓冲液，主要成分为50%甘油，100mMEDTA（pH=8.0），1%SDS和0.1%溴酚蓝。用饱和酚、氯仿抽提DNA方法纯化。当前第44页\共有97页\编于星期五\22点10、酶切反应的操作过程配酶解体系混匀反应终止酶解结果鉴定ddH2O+buffer+DNA+酶一般20μl，酶体积不超过总体积的10%，尽量降低反应总体积。DNA量大的情况下，可适当放大反应体系。移液枪吹打或手指轻弹管壁应避免强烈振荡。离心机短暂离心，使管壁液体全部下沉。琼脂糖凝胶电泳200010007505002501001：pBS-T空载体（EcoRⅠ+HindⅢ）；2,3：重组质粒（EcoRⅠ+HindⅢ）；4：目的基因；当前第45页\共有97页\编于星期五\22点10.Ⅱ型限制性内切酶的主要用途当前第46页\共有97页\编于星期五\22点BamHIEcoRIBamHI思考题1载体基因1500bp2000bp如何将该基因完整片段整合到载体上？当前第47页\共有97页\编于星期五\22点方法1：单酶切BamHI载体基因1500bp2000bpBamHIEcoRI载体EcoRIEcoRI缺点？当前第48页\共有97页\编于星期五\22点如何鉴定单酶切连接产物方向BamHIEcoRIBamHI载体基因1500bp2000bp当前第49页\共有97页\编于星期五\22点方法2：部分酶切（双酶切）BamHI载体基因1500bp2000bpBamHIEcoRI载体EcoRI缺点？BamHIEcoRIBamHIBamHI当前第50页\共有97页\编于星期五\22点EcoRIBamHIBamHI1.EcoRI完全酶切EcoRIBamHIBamHI2.BamHI部分酶切EcoRIBamHIBamHI部分酶切的方法？部分酶切的结果多少条带？1500bp2000bp13510min当前第51页\共有97页\编于星期五\22点方法3：同尾酶（双酶切）BamHI载体基因1500bp2000bpBamHIEcoRI载体EcoRI缺点？BamHIEcoRIBgl

IIBamHIBglII?MunI?当前第52页\共有97页\编于星期五\22点GCCTAG

AATTCGGATCCGGCTTAA

GATCCGGCTTAA

BamHIEcoRIBamHIEcoRI当前第53页\共有97页\编于星期五\22点第二节DNA连接酶1、DNA连接酶（ligase)的发现1967年，世界上数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶。

定义：一种能够催化双链DNA片段靠在一起的3′羟基末端与5′磷酸基团末端，通过磷酸二酯键连接在一起的核酸酶当前第54页\共有97页\编于星期五\22点2、DNA连接酶的性质修复DNA-DNA双链上的单链缺口；连接RNA-DNA杂交双链上的DNA单链缺口；连接两个完全断开的平末端双链DNA分子。X当前第55页\共有97页\编于星期五\22点DNA连接酶催化的连接反应特点：需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P)。利用NAD或ATP作能源。不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分。只封闭缺口，不封闭裂口。当前第56页\共有97页\编于星期五\22点3、常用的DNA连接酶对RNA-DNA分子无效活性低，不常用当前第57页\共有97页\编于星期五\22点4、DNA连接酶作用机理ATP（NAD+)提供激活的AMP。ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。当前第58页\共有97页\编于星期五\22点5、影响连接反应的因素1）反应温度连接酶反应的最佳温度是37C。实用温度粘性末端：一般采用4-16C。平末端：一般采用10-20C。但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。当前第59页\共有97页\编于星期五\22点

T4DNA连接酶的活性一般用Weiss单位来衡量，即37℃条件下20min内可使1nmol/L32P在有机焦磷酸与ATP之间产生交换的酶量为1个活性单位。黏性末端连接酶浓度0.1单位以上即可，而平末端连接可能需要1-2个活性单位。

反应时间，在16℃时，4h即可，而在4℃时则需连接过夜。2）连接酶浓度当前第60页\共有97页\编于星期五\22点3）ATP浓度一般，浓度范围在10μmol-1mmol/L，ATP最适的终浓度为0.5mmol/L。ATP浓度高至5mmol/L，影响平头末端的连接。ATP浓度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平头末端的连接。当前第61页\共有97页\编于星期五\22点

相同的分子末端间存在竞争，形成不同构型的DNA分子（自身环化、线形多聚体、环化多聚体以及重组质粒）。分子越小、浓度越低越容易形成自身环化；另要注意载体与目的DNA浓度之比。4.DNA片段末端类型与浓度插入片段：载体=3:1增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。单酶切产物连接比例需要更高。当前第62页\共有97页\编于星期五\22点从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。6、平头双链DNA片段的连接操作提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM当前第63页\共有97页\编于星期五\22点7、DNA连接的反应体系DNA+vector3:1ligase0.5-1UH2Oupto10-20ulligasebuffer当前第64页\共有97页\编于星期五\22点第三节DNA聚合酶1、基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow聚合酶、TaqDNA聚合酶T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、逆转录酶当前第65页\共有97页\编于星期五\22点1）共同特点把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端，催化核苷酸聚合，合成与模板互补的DNA序列2）主要区别T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。2、常用DNA聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。当前第66页\共有97页\编于星期五\22点当前第67页\共有97页\编于星期五\22点当前第68页\共有97页\编于星期五\22点3'→5'外切酶活性──校对作用：这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物dNTP时，由于没有聚合作用而出现暂时的游离现象，从而被3'→5'外切酶活性所降解。当向反应体系加入dNTP，而且只加放与模板互补的上述核苷酸才会使这种外切酶活性受到抑制，并继续进行DNA的合成。由此推论，3'→5'外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被3'→5'外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。当前第69页\共有97页\编于星期五\22点5'→3'外切酶活性──切除修复作用：5'→3'外切酶活性就是从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分（双链）磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5'→3'。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5'末端RNA引物的去除依赖此种外切酶活性。当前第70页\共有97页\编于星期五\22点3、常用DNA聚合酶的用途1）大肠杆菌DNA聚合酶I(PolI)活性:5`→3`聚合活性,5`→3`外切和3`→5`外切活性发挥生物学活性的条件：（1）DNA模板（可以是单链或双链）（2）带有3`-端游离羟基(3'-OH)的引物链（3）底物和激活剂应用:缺口平移法(nicktranslation)标记DNA探针注:对双链DNA，当有dNTPs存在时，3`→5`降解活性会

被5`→3`方向的聚合活性所抑制。当前第71页\共有97页\编于星期五\22点当前第72页\共有97页\编于星期五\22点缺口DNaseIDNA聚合酶IDNA聚合酶IdNTP*缺口缺口平移法制备DNA分子探针当前第73页\共有97页\编于星期五\22点2.Klenow聚合酶Klenow聚合酶即大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（klenowfragment)活性:具有5'3’聚合酶活性和3'5’外切酶活性.

(失去了5'3'外切酶活性）用途：当前第74页\共有97页\编于星期五\22点当前第75页\共有97页\编于星期五\22点从栖热水生菌（Thermusaquaticus）分离，最适温度75℃-80℃。特点：热稳定性70℃反应2h残留活性为原来的90%；93℃反应2h残留活性为原来的60%；94℃反应2h残留活性为原来的40%。活性：具有5'3’聚合酶活性和5'3'外切酶活性.

(无3'5’外切酶活性）应用：（1）DNA序列测定（2）PCR：对DNA的特定片段进行体外扩增3.TaqDNA聚合酶当前第76页\共有97页\编于星期五\22点4.T4DNA聚合酶T4-DNA酶的基本特性：与klenow聚合酶一样，但是3`→5`

的核酸外切酶活性要强200倍。有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸在四种dNTP均存在时，聚合酶活性占主导地位当前第77页\共有97页\编于星期五\22点切割3'凸出末端补平5'凸出末端DNA3'端标记当前第78页\共有97页\编于星期五\22点5.T7DNA聚合酶活性:5`→3`聚合酶活性；3`→5`外切酶活性，无5`→3`外切酶活性特点:与T4DNA聚合酶相似，3`→5`外切酶活性更强，为klenow聚合酶的1000倍，并具有极佳的连续合成能力,不受DNA二级结构的影响。应用：（1）用于长模板DNA的引物延伸反应；（2）通过单纯的延伸或取代合成途径标记DNA的3`末端；（3）使双链DNA的5`或3`突出末端变成平末端测序酶：化学方法修饰的T7DNA聚合酶，无外切酶活性，修饰后聚合酶活性增加3倍。更适合序列分析。当前第79页\共有97页\编于星期五\22点逆转录酶(reversetranscriptase)：又称为RNA指导的DNA聚合酶。活性：具5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是带3`-OH的RNA或DNA。6.逆转录酶AMV反转录酶(禽类骨髓细胞瘤病毒)：具反转录酶活性，强RNaseH活性。反应温度42℃，最适pH8.3。小片段cDNA的反转录；M-MLV反转录酶(小鼠白血病病毒)：具反转录酶活性，弱RNaseH活性，以RNA-DNA为底物的5’-3’外切酶活性。反应温度37℃，42℃时迅速失活，最适pH7.6。反转录的cDNA片段可达5kb。当前第80页\共有97页\编于星期五\22点反转录实验：去除DNA（DNase消化）RNA变性（65℃5min立即冰浴）引物结合（polyA\随机引物\特异引物）cDNA合成（42℃）bufferdNTP反转录酶可加RNase抑制剂当前第81页\共有97页\编于星期五\22点第四节修饰酶一、碱性磷酸酶功能：

催化核酸脱去5`-磷酸基团，使DNA或RNA片段5`-P末端转换成5`-OH末端。来源：有两种，分别来自于大肠杆菌和小牛肠道，前

者叫bacterialalkalinephosphatase(BAP);后

者叫calfintestinalalkalinephosphatase(CIAP)当前第82页\共有97页\编于星期五\22点主要用途：在用32P标记DNA5’端之前，去除5'端的磷酸；在DNA重组技术中，去除DNA片段5'磷酸，防止载体的自身环化。当前第83页\共有97页\编于星期五\22点二、T4多核苷酸激酶1.来源T4polynucleotidekinase由T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2.功能催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。不论5’-OH端突出与否。3.多核苷酸激酶的用途DNA5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端使缺失5`-P末端的DNA发生磷酸化作用当前第84页\共有97页\编于星期五\22点三、末端转移酶是末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltansferase,TdT）的简称，来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3'-OH端增加一个或多个脱氧核苷酸特点①5’3’DNA聚合酶活性②不需要模板！③底物可以是单链DNA、3’-OH