细胞增生和凋亡的分子演示文稿

细胞增生和凋亡的分子演示文稿当前第1页\共有72页\编于星期四\10点（优选）细胞增生和凋亡的分子当前第2页\共有72页\编于星期四\10点第一节生长因子信号转导活化细胞周期进程是细胞增生的分子机制第二节细胞凋亡是一种自发的程序性死亡当前第3页\共有72页\编于星期四\10点细胞周期细胞周期:大多数真核细胞经过一系列有序事件，使细胞体积增大，染色体复制，并且分裂成两个各含有一套完整的染色体的子代细胞细胞周期分为四个时期：G1,S,G2,M期当前第4页\共有72页\编于星期四\10点当前第5页\共有72页\编于星期四\10点G1期：从有丝分裂完成到DNA复制之前这一阶段，又叫复制前期。该期细胞内各种RNA、蛋白质合成增多。同时各种细胞群体之间细胞周期的差异取决于此期。S期：又称为DNA的合成期或复制期。该期细胞内遗传物质从二倍体到四倍体。组蛋白的合成也同时进行。当前第6页\共有72页\编于星期四\10点G2期：指DNA合成完成到有丝分裂开始这段时间，又称复制后期。该期DNA合成已终止，但仍然进行RNA和一定蛋白质的合成。同时线粒体DNA在此期复制。M期：又称为有丝分裂期。此期细胞呈球形，染色体在此期凝聚后分开，移向细胞两端，解聚并在形成两个完整的核，最后通过细胞质分裂，结束M期。该期蛋白质合成也显著减少，细胞质内的多核糖体大部分解体。当前第7页\共有72页\编于星期四\10点G1-SCheckpoint细胞周期中的四个关卡（checkpoint）：G1晚期限制点、G1-S转折和G2-M转折的DNA损伤关卡、有丝分裂中期关卡IsthedamagedDNArepaired?当前第8页\共有72页\编于星期四\10点二、有许多蛋白质参与调控细胞周期进程周期蛋白（Cyclin）周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependentkinase,Cdk）周期蛋白-周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）RB及E2F-DP1转录因子调节Cdk磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶泛素（ubiquitin）和使蛋白质泛素化（ubiquitination）的酶当前第9页\共有72页\编于星期四\10点1.细胞周期蛋白是一类含量随着不同细胞周期升高和降低的蛋白质，可分为A、B、D、E等。当前第10页\共有72页\编于星期四\10点细胞周期蛋白影响细胞内的含量因素基因表达增加—生长因子诱导降解—泛素介导运输—细胞核与细胞间质间当前第11页\共有72页\编于星期四\10点2.细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependentkinase,Cdk）Cdk是组成型表达的核内丝-苏氨酸蛋白激酶当前第12页\共有72页\编于星期四\10点部分周期蛋白结构分子特征周期蛋白盒介导周期蛋白与Cdk结合破坏框（Destructionbox,RXXLGXIXN）(X代表任意氨基酸)，破坏框之后为一段40个氨基酸组成的Lys富集区，破坏框主要参与由泛素介导的周期蛋白A和周期蛋白B的降解。PEST（脯、谷、丝、苏）与G1期周期蛋白的更新有关当前第13页\共有72页\编于星期四\10点当前第14页\共有72页\编于星期四\10点某些CKD与周期蛋白的配对关系及执行功能的时期当前第15页\共有72页\编于星期四\10点3.CKI(cyclin-dependentkinaseinhibitor)抑制Cdk及周期蛋白-Cdk复合物的活性1.Cdk4/Cdk6抑制因子家族有P15、P16、P18、P19等。抑制CyclinD与Cdk4/Cdk6结合，及其复合物的激酶活性。2.Cip/Kip家族Cytokine-inducibleprotein/kinaseinteractingprotein有P21、P27、P57等。是细胞接受到接触抑制、DNA损伤、低氧及某些细胞因子等信号后的产物；与Cyclin-Cdk复合物结合，抑制它们的活性当前第16页\共有72页\编于星期四\10点1.Cdk4/Cdk6抑制因子家族2.Cip/Kip家族当前第17页\共有72页\编于星期四\10点4.Rb蛋白与转录因子E2F-DP1的结合对G1期进展产生负调节作用Rb(retinoblastomaprotein)（视网膜母细胞瘤基因）RB基因产物是一个核内蛋白，有两种形式，磷酸化和去磷酸化。RB的表达和磷酸化水平与细胞周期有关当前第18页\共有72页\编于星期四\10点当前第19页\共有72页\编于星期四\10点5.使Cdk磷酸化和去磷酸化的酶也调节Cdk的活性CDK1的调节与活化;CAK=CDK1-ActivitingKinase当前第20页\共有72页\编于星期四\10点6.泛素-蛋白酶体介导蛋白质降解也起调节细胞周期的作用短命蛋白通过多泛素化途径降解，如Cyclin、P21、P27、E2F、Weel等。当前第21页\共有72页\编于星期四\10点参与细胞周期调控的泛素连接酶至少有两类SCF（skp1-cullin-F-boxprotein，三个蛋白构成的复合体）负责将泛素连接到G1/S期周期蛋白（D、E）和p21、p27、E2F、Weel上；APC(anaphasepromotingcomplex)负责将泛素连接到M期周期蛋白（A、B）上。

当前第22页\共有72页\编于星期四\10点当前第23页\共有72页\编于星期四\10点三，调节蛋白协同作用调控细胞周期Cdk4/6和Cdk2的活化是限制点处调控的关键因素Cdk1活化是G2M关卡处关键调控因素APC介导的多泛素化蛋白降解是细胞离开M期进入G1期的关键调控因素DNA损伤关卡与G1及G2期停滞相关当前第24页\共有72页\编于星期四\10点1.Cdk4/6和Cdk2的活化是限制点处调控的关键因素当前第25页\共有72页\编于星期四\10点当前第26页\共有72页\编于星期四\10点2.Cdk1活化是G2M关卡处关键调控因素当前第27页\共有72页\编于星期四\10点当前第28页\共有72页\编于星期四\10点3.APC介导的多泛素化蛋白降解是细胞离开M期进入G1期的关键调控因素后期促进因子(AnaphasePromotingComplexAPC）介导选择性降解的靶蛋白与Ubiquitin结合(通过泛素依赖性途径降解)。APC主要介导两类蛋白降解:AnaphaseInhibitors和MitoticCyclin。前者维持姐妹染色单体粘连,抑制后期启动；后者的降解意味着有丝分裂即将结束，即染色体开始去凝集，核膜重建。当前第29页\共有72页\编于星期四\10点当前第30页\共有72页\编于星期四\10点4.DNA损伤关卡与G1及G2期停滞相关G2期的停滞涉及一系列的磷酸化过程转录因子P53能使细胞停滞在G1期和G2期当前第31页\共有72页\编于星期四\10点G2期的停滞涉及一系列的磷酸化过程当前第32页\共有72页\编于星期四\10点转录因子P53能使细胞停滞在G1期及G2期当前第33页\共有72页\编于星期四\10点四，生长因子等细胞外因素通过信号转导调控细胞周期细胞从G0期进入细胞周期依赖多种生长因子的协同促进作用当前第34页\共有72页\编于星期四\10点G1期的细胞也需要生长因子促进细胞周期的进程当前第35页\共有72页\编于星期四\10点第二节细胞凋亡是一种自发的程序化细胞死亡细胞凋亡机制涉及胱天蛋白酶的级联活化死亡受体途径及线粒体途径是两种主要的凋亡信号转导途径当前第36页\共有72页\编于星期四\10点细胞死亡分为两大类：1、由各种突发的，意外的事件所致的细胞死亡(病理性死亡)，形态学上表现为细胞坏死(necrosis)。2、程序性细胞死亡，形态学上表现为细胞凋亡(apoptosis)。凋亡是多细胞生物发育及成体中维持体内平衡的一种正常事件当前第37页\共有72页\编于星期四\10点例如蝌蚪尾的消失脊椎动物的神经系统的发育发育过程中手和足的成形过程当前第38页\共有72页\编于星期四\10点当前第39页\共有72页\编于星期四\10点细胞凋亡与细胞坏死的区别—————————————————————————————————————————————————————————坏死凋亡1.性质2.诱导因素强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生3.生化特点4.形态变化6.DNA电泳5.炎症反应7.凋亡小体8.基因调控被动过程，无新蛋白合成，不耗能主动过程，有新蛋白合成，耗能细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩弥散性降解，电泳呈均一DNA片状DNA片段化(180-200bp)，电泳呈“梯”状条带溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应有病理性，非特异性生理性或病理性，特异性无有无当前第40页\共有72页\编于星期四\10点坏死凋亡当前第41页\共有72页\编于星期四\10点确保胚胎发生、器官发育，调节细胞群体维持内环境稳定发挥积极的防御功能凋亡的生理意义凋亡的病理意义器官功能障碍凋亡的意义恶性肿瘤发生当前第42页\共有72页\编于星期四\10点二，凋亡途径是由诱导产生的胱天蛋白酶级联反应凋亡途径最早在线虫中被阐明秀丽隐杆线虫（CaenorbabditisElegans)当前第43页\共有72页\编于星期四\10点麻省理工学院的RobertHorvitz领导的研究小组采用体细胞突变的方法发现共有14个基因在C.elegans细胞凋亡中起作用当前第44页\共有72页\编于星期四\10点TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2002"fortheirdiscoveriesconcerning'geneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath'"SydneyBrenner

H.RobertHorvitz

JohnE.Sulston

TheMolecularSciencesInstitute

Berkeley,CA,USAMassachusettsInstituteofTechnology(MIT)

Cambridge,MA,USATheWellcomeTrustSangerInstitute

Cambridge,UnitedKingdom当前第45页\共有72页\编于星期四\10点

Duringdevelopment,1090cellsaregenerated,butprecisely131ofthesecellsareeliminatedbyprogrammedcelldeath.Thisresultsinanadultnematode(thehermaphrodite),composedof959somaticcells.当前第46页\共有72页\编于星期四\10点当前第47页\共有72页\编于星期四\10点2.哺乳动物细胞凋亡途径与线虫凋亡途径相似但更为复杂Ced3---胱天蛋白酶（cysteinylaspartate-specificprotease,caspase）Ced4---凋亡蛋白酶活化因子1（apoptoticprotease-activatingfactor1,Apaf1）Ced9和Egl-1---Bcl-2家族当前第48页\共有72页\编于星期四\10点3.哺乳动物中Caspase家族成员有相似的结构与活化过程当前第49页\共有72页\编于星期四\10点当前第50页\共有72页\编于星期四\10点4.哺乳动物的Bcl-2家族是凋亡调节蛋白当前第51页\共有72页\编于星期四\10点二，死亡受体途径及线粒体途径是两种主要的凋亡信号转导途径当前第52页\共有72页\编于星期四\10点1.死亡受体途径死亡受体：Fas、TNFR1、TNFR2、DR3、DR4、DR5、DcR1和DcR2等一类通过与相应配体结合，传递细胞凋亡信号的跨胞膜蛋白。通路：当前第53页\共有72页\编于星期四\10点当前第54页\共有72页\编于星期四\10点TNF受体途径1、TNF和TNF受体TNF(tumornecrosisfactor)：称为肿瘤坏死因子，是一种具有多种生物学效应的细胞因子，主要由激活的单核巨噬细胞和T淋巴细胞产生。TNF受体：目前发现的有TNFR1和TNFR2。两种都为跨膜蛋白。TNFR1能引起细胞凋亡，而TNFR2却不能引起细胞凋亡。当前第55页\共有72页\编于星期四\10点2、TNF受体途径的作用：促进细胞生长、分化、凋亡和诱发炎症。3、TNF受体途径:1）TNF－α与TNFR1胞外区结合，使TNFR1形成三聚体。（一个TNF－α与三个TNFR1分子结合）2）三聚体TNFR1通过其聚集的胞内区死亡结构域（DD）招募下游信号传导蛋白（TRADD、FADD、TRAF2、RIP）。3）下游信号传导蛋白形成复合体，激活下游的caspase8以及各种效应分子caspases，产生级联激活反应，最终引起靶细胞凋亡。4）TNF还可通过下游激活蛋白RIP，TRAF2等，分别激活NIK和MEKK，从而激活NF－KB和c－Jun，抑制细胞凋亡。当前第56页\共有72页\编于星期四\10点TNF受体途径当前第57页\共有72页\编于星期四\10点2.内源性线粒体途径当前第58页\共有72页\编于星期四\10点3.细胞凋亡的检测方法.一、细胞凋亡的形态学检测.二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）三、线粒体膜势能（mt）的检测四、DNA片断化检测

五、TUNEL法六、Caspase-3活性的检测

七、WB检测当前第59页\共有72页\编于星期四\10点

细胞凋亡的形态学检测

1光学显微镜和倒置显微镜

未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI。3电子显微镜观察当前第60页\共有72页\编于星期四\10点NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess

（488nm400）当前第61页\共有72页\编于星期四\10点电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。当前第62页\共有72页\编于星期四\10点磷脂酰丝氨酸（PS）外翻分析（AnnexinV法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，