第十三讲蛋白质分子设计

第十三讲蛋白质分子设计第一页，共三十三页，编辑于2023年，星期一第三节天然蛋白质的剪裁天然蛋白质的剪裁—“中改”，是指在蛋白质中替换1个肽段或者1个结构域的分子操作技术。蛋白质的立体结构可以看作由结构元件组装而成的，因此将不同蛋白质之间结构元件成段地替换期望能够转移相应的功能。“中改”操作，在新型抗体的开发中已有广泛应用。谈2个问题：一是抗体剪裁，二是蛋白质关键残基嫁接第二页，共三十三页，编辑于2023年，星期一一、抗体剪裁抗体的基本结构：四链结构四肽链：由2条重链（H链），2条轻链（L链）组成；结构域：IgG——H链4个，L链2个；抗体识别位点组成：由轻、重二链1个结构域的高可变区共同构成。抗原决定子互补区：抗体分子可变区的一些环状肽段组成的。抗原表位抗体识别位点第三页，共三十三页，编辑于2023年，星期一一、抗体剪裁人—鼠嵌合抗体的制备（思路）利用分子剪裁技术对抗体分子进行剪裁的成功实例——实验英国剑桥大学的Winter等。将小鼠单抗的V区，换到人抗体分子的相应部位上，使小鼠单抗所具备的抗原结合专一性转移到人的抗体分子上。单克隆抗体（单抗，McAb）？抗体剪裁的医学价值与人McAb相比，小鼠McAb容易制备，抗原性强，但易导致人体过敏反应。将鼠McAb抗原结合部位转移到人抗体上，达到与人McAb同样的效果。抗体剪裁第四页，共三十三页，编辑于2023年，星期一1、抗体的人源化新的挑战：改造鼠源McAb基因，综合人—鼠嵌合McAb的优点；获得特异性高、异源性小的，具有临床应用价值的抗体。为何要人源化？相对于“人”杂交瘤细胞系统，“鼠”杂交瘤细胞生长快，产生抗体量大。鼠McAb用于人体，免疫原性和相对缺乏恒定区依赖的功能效应，使它的应用受到了一定的限制。改造的必要性：对鼠源McAb进行蛋白质工程改造，合成人源化单抗。Ab的作用（补充）：识别作用：特异性与抗原分子结合生物效应：调理作用、免疫粘联、激活补体第五页，共三十三页，编辑于2023年，星期一（1）鼠单克隆抗体恒定区的人源化将小鼠McAb恒定区用人抗体恒定区代替而拼接成嵌合抗体，既具有抗原结合特异性，又极大地降低了鼠单克隆抗体的异源性。改造策略和程序：①克隆鼠McAb可变区基因——从鼠杂交瘤提取mRNA→可变区基因cDNA文库→表达载体→抗原特异性筛选→可变区基因；②选择合适的人恒定区基因；恒定区基因比较保守，易于克隆获得③重组载体的构建与表达抗体分子的糖基化和可变区的折叠、链内二硫键形成，以及重链和轻链相互作用形成正确的立体构象。常用哺乳类细胞表达系统第六页，共三十三页，编辑于2023年，星期一CH3MouseHumanChimericCH3VHCH1VLCLCH2HCLC第七页，共三十三页，编辑于2023年，星期一（2）人改型抗体（互补决定区移植）

问题提出：人源化嵌合抗体的可变区仍具有抗原性。能诱发人产生抗小鼠抗体，导致过敏反应，需对人源化抗体的可变区再进行改造。抗体可变区组成：互补决定区（CDR）和骨架区组成。CDR：识别抗原表位的区域，直接决定了抗体的特异性；骨架区

——维持CDR构象骨架区序列及其立体结构较为保守，是嵌合抗体诱导人抗小鼠抗体的主要原因；将鼠McAbCDR移植到人McAb的可变区的骨架上，使人McAb获得鼠McAb结合特异性，进一步减少异源性。互补决定区移植的设计简单地将CDR序列移植到人源抗体中，甚至完全丧失亲和力。必须进行互补决定区序列与框架结构的移植设计。第八页，共三十三页，编辑于2023年，星期一移植设计的原则将CDR序列和紧邻两侧的骨架序列一起移植；对骨架区中影响抗原结合部位的aa残基改为鼠源McAb的残基；人McAb可变区序列的选择：抗体可变区序列数据库分析，选择与鼠单克隆抗体同源性高的人源序列；保留可变区N末端aa序列，尤其是轻链可变区N末端序列。将人改型可变区基因与人lg恒定区基因连接，构成完整的人改型基因进行表达。第九页，共三十三页，编辑于2023年，星期一2、抗体的小分子化改造小分子抗体？能与抗原结合的抗体小分子V区片段——称~，具识别活性 主要包括4类

Fab抗体：酶水解法：用木瓜水解酶消化抗体可获得2个Fab片段。2条肽链

基因工程方法：在Fab基因表达Fab片段的功能。H链和L链基因分别构建，在2个载体上，共转染细胞，或者构建在一个载体上转染细胞进行表达。

Fv抗体：Fv是由轻链和重链可变区组成的单价小分子，是与抗原结合的最小功能片段。2条肽链

分别构建含H和L可变区基因的载体，共转染细胞，使之各自表达后组装成功能性Fv分子；或在一个载体中H可变区和L可变区基因之间设置终止密码子，分别表达2个小分子片段。

单链抗体（ScFv）：将轻链和重链的可变区连接起来的抗体。1条肽链单价抗体的特点：优点：分子量小，免疫原性弱、渗透力强，并可用于药物导向、中和毒素等功能。缺点：无抗体C区，不能介导抗体的其他生物学效应。双价抗体片段：利用单价抗体片段构建双价单特异性抗体和双价多特异性抗体。第十页，共三十三页，编辑于2023年，星期一

3、双特异性抗体（完整抗体）双特异性抗体(BsAb)？也称双功能抗体或杂交抗体，为非天然抗体。2个抗原结合部位，具有不同的特异性化学结构上是双价的，结合抗原的功能上是单价的；不同于天然抗体（在化学结构及功能上均是双价的）BsAb具有双特异性，能交联2种抗原，可介导标记物与靶抗原结合（造影）。双特异性抗体制备方法化学交联双特异性抗体：制备单价抗体，双功能交联剂交联。细胞工程双特异性抗体：通过细胞融合的方法制备双特异性抗体。可将分泌单抗的杂交瘤与经免疫的脾细胞融合，或使两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤彼此融合。基因工程双特异性抗体：体外组装表达分泌型的双特异性抗体。药物—靶细胞第十一页，共三十三页，编辑于2023年，星期一

4、基因工程抗体基因的表达概述：蛋白质的表达系统有很多，其中主要包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物类细胞、昆虫细胞及植物细胞等表达系统。抗体分子表达：常用大肠杆菌和哺乳类细胞。大肠杆菌：原核细胞表达系统。成熟的基因克隆、蛋白表达体系，具有繁殖迅速、易于操作控制等优点。缺乏蛋白质加工系统，内源性蛋白酶易降解外源蛋白，内毒素导致人体热源反应仅可用于表达抗体片段，如单链抗体等。难以表达完成的抗体哺乳类细胞：真核细胞表达体系，可完成正确的蛋白质修饰和装配，更接近天然抗体，具有正常的生物活性；缺点是成本高，操作相对烦琐。第十二页，共三十三页，编辑于2023年，星期一二、蛋白质关键残基嫁接蛋白质之间相互作用，往往只有几个非常关键的aa残基对结合起到主要作用，并不是全部蛋白分子参与。思考——如何证明这一命题？基于这种情况，我国科学家来鲁华教授课题组发展了一种“蛋白质关键残基嫁接”的方法。成功地将EPO的关键残基“嫁接”到一个结构完全不同的PH蛋白结构域上，ERPH1蛋白具有了和EPOR结合的功能。促红细胞生成素(EPO)—受体(EPOR)相互作用，促进红细胞的分化和成熟。来鲁华教授北京大学化学学院长江特聘教授第十三页，共三十三页，编辑于2023年，星期一1987年开始从事化学与生物学的交叉研究，特别是生物信息学研究，在蛋白质结构预测及分子设计方面做过大量工作。近年的主要工作方向为蛋白质-蛋白质相互作用研究，发展了用于蛋白质-蛋白质相互作用定量研究的平均势方法。有关蛋白质表面环区结构预测及蛋白质设计、基于结构的药物设计等程序目前在国际上拥有900多家注册用户。

来鲁华教授北京大学化学学院长江学者特聘教授，北京大学理论生物学中心常务副主任，分子动态与稳态国家重点实验室主任，国家杰出青年基金获得者。来鲁华，博士，教授1984年，本科毕业于北京大学化学系。1989年，在北京大学化学系获博士学位。1998-1999年，美国加州大学伯克莱分校伯克莱学者。承担过国家自然科学青年基金，国家杰出青年基金，攀登计划（国家基础研究重大计划）项目，八六三项目等。国家自然科学三等奖1次，求是基金会青年科学家奖励，中国科协青年科技奖等。发表论文近百篇，其中SCI收录论文80余篇。头衔学历进修贡献研究方向与兴趣个人简历是自己的经历！如何写好，关键做好！详细情况加附页——略长江学者奖励计划：国家教育部与香港爱国实业家李嘉诚基金会第十四页，共三十三页，编辑于2023年，星期一本节小结天然蛋白质的剪裁，又称蛋白结构的“中改”，是指在蛋白质中肽段或者结构域替换和拼接。蛋白质的立体结构是由结构元件组装而成的，通过不同蛋白质之间结构元件替换和拼接。期望能够转移相应的功能和特性。本节主要通过抗体分子的拼接和改进进行了论述。抗体的人源化（恒定区，CDR区）抗体的小分子化：双链（Fab和Fv）、单链（Fab和Fv）、双价抗体片段双特异性抗体蛋白质关键残基嫁接——实例（方法建立——来鲁华教授）第十五页，共三十三页，编辑于2023年，星期一第四节蛋白质分子全新设计一、蛋白质分子全新设计的程序全新设计？：基于天然蛋白质结构，以及对蛋白质结构与功能关系的认识为基础。根据期望的结构和功能来设计全新序列的分子。全新设计流程（7）确定设计目标生成初始序列结构预测构建模型对序列进行初步的优化基因表达全新蛋白质结构和功能检测进一步设计蛋白质设计一般都要经过反复多次设计一合成一检测一再设计的过程。主要介绍三个环节→设计目标的选择设计方法结构检测第十六页，共三十三页，编辑于2023年，星期一1、设计目标的选择蛋白质全新设计分类：（两个方面）。功能设计和结构设计。重点和难点：结构设计。Why？设计思路：结构设计方面：从最简单的二级结构开始，摸索蛋白质结构稳定的规律。设计目标：在超二级结构和三级结构设计中，一般选择天然蛋白质结构中一些比较稳定的模块。如：四螺旋束和锌指结构等。功能设计方面：主要进行天然蛋白质功能的模拟，如：金属结合蛋白和离子通道等。第十七页，共三十三页，编辑于2023年，星期一2、设计方法（3种）序列最简化法：蛋白质分子全新设计的一种基本方法，理解蛋白结构形成的基本规律。尽量使设计序列的复杂性最小，一般仅用很少几种氨基酸，从简单到复杂设计的多肽序列具有一定的对称性或周期性。。用来理解蛋白质的折叠规律，如：HP模型法（蛋白质折叠研究模型）。模板组装合成法

（Mutter，1988）：其思路是将各种二级结构片段通过共价键连接到一个刚性的模板分子上，形成一定的三级结构。模板组装合成法——绕过了蛋白质三级结构设计的难关，再通过改变二级结构中的AA残基来研究蛋白质中AA间的长程作用力揭示蛋白质折叠规律，也是探索蛋白质全新设计规律的有效手段。自动设计方法——提高了设计的速度和效率，已发展多种方法。结合一定的规则和算法，由计算机完成设计。如：运用蛋白质反向折叠方法结合遗传算法建立自动设计方法—Jones运用三维剖面技术结合遗传算法发展的自动设计方法——来鲁华等第十八页，共三十三页，编辑于2023年，星期一3、结构检测（设计蛋白质）只有实践检验，才能判断设计是否与预想结构（结果）符合。检测项目和方法：（一般从三方面）设计的蛋白质是否为多聚体排阻色谱法——判断分子以几聚体形式二级结构含量是否与目标符合CD法——检测各二级结构的大致含量是否具有预定的三级结构。主要依靠NMR技术和荧光分析（下面介绍）；也可使用X射线晶体衍射技术分析。第十九页，共三十三页，编辑于2023年，星期一二、蛋白质结构的全新设计核心问题：如何确定一个既非常稳定而又具有独特的空间结构的序列。克服的基本障碍：线性聚合链的构象熵。熵增（ΔS）？序列（正确）折叠的相互作用（力），必须超过（大于）构象熵。？设计时，使具有相互作用力的AA数目与强度达到最大。设计原则和经验：Cys残基形成二硫键的配对无法预测，一般都尽量少用甚至不用，特别是在自动设计方法中。序列完成预定折叠后，再引入二硫键来稳定蛋白质的三级结构。色氨酸吲哚环具有生色性，与其所处环境有关，常以Trp做探针？Trp在天然态蛋白质分子内部，其荧光光谱发生蓝移。（？）在全新设计中常引入Trp作为荧光探针以检验设计蛋白质的三级结构。下面介绍各级结构设计的原则从四个方面讲述第二十页，共三十三页，编辑于2023年，星期一1、二级结构的设计（α、β、T）（1）螺旋的设计α螺旋的设计——研究较早而且研究得较多的结构。Why？由于a螺旋结构简单，规律性强，在溶液中比较稳定。设计指导原则（4个）：选择氨基酸：形成α螺旋倾向性比较大的残基，如：Leu、Glu、Ala和Met等；氨基酸排列：螺旋每圈平均3.6个残基，设计的两亲性螺旋，其结构中形成一个亲水面和一个疏水面，疏水性AA残基应按3或4的间隔排列；氢键的指向：α螺旋中所有的氢键指向同一方向，沿螺旋轴形成一个由N端指向C端的偶极矩，因而设计α螺旋时，常使带正电荷的AA残基靠近C端，带负电荷的AA残基靠近N端；帽子结构：由于a螺旋两端各有3个残基的氢键能力未得到全部满足，为稳定a螺旋，常常在其两端各加一个N帽和C帽。形成N帽的氨基酸残基有Gly、Asn、Ser和Met等，形成C帽的有Gly、Ser、Arg和Gln等。第二十一页，共三十三页，编辑于2023年，星期一（2）β折叠片结构设计β折叠片的设计比α螺旋困难。Why？β折叠片的氢键在不同的β折叠股间形成，由此β折叠片的形成与序列的“上下文”的关系更密切。单个氨基酸残基平均形成的氢键数较螺旋中少，结构稳定性较差。单条β折叠股结构不能稳定存在。如何来研究？有了方法才能进行研究——模板组装合成法

将序列固定在一个模板上，来研究其形成规律。β折叠片的设计原则：根据模型肽、全β结构、α/β结构蛋白质设计的经验选择形成β折叠片倾向性较大的氨基酸残基(如Val、Ile、Tyr)使亲水性残基和疏水性残基相间排列。第二十二页，共三十三页，编辑于2023年，星期一（3）转角的设计：转角的作用：连接不同二级结构的常见单元，对维持各种二级结构的空间相对位置和稳定蛋白质的三级结构起着重要的作用。不同类的转角对每个位置的氨基酸残基的二面角有一定的要求。二面角决定连接的两个二级结构的空间关系。转角设计的关键选择合适的转角类型。某些氨基酸残基对蛋白质的二级结构有终止作用如：Pro和Gly是α螺旋的中断者；Glu是β—折叠的中断者；设计时可利用这些氨基酸残基来终止和分隔不同的二级结构。第二十三页，共三十三页，编辑于2023年，星期一2、超二级结构和三级结构的设计主要结构类别：α-α；β

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β，β-发夹；三级结构；全蛋白。设计的重要问题（两个）氨基酸选择：根据AA形成二级结构的倾向性，选择各二级结构片段的氨基酸残基疏水中心的形成：最重要的一点就是考虑疏水中心的形成。螺旋—螺旋结构：很多跨膜蛋白中存在，是研究得比较多的超二级结构。序列有一个明显的结构特征，即存在一个周期性重复的七肽例如：七肽abcdefg，其中a和d位置处于螺旋间的界面因而设计时应选择疏水性氨基酸残基，其他位置暴露的表面，应选择亲水的氨基酸残基。第二十四页，共三十三页，编辑于2023年，星期一β-发夹结构（另一种常见的超二级结构）合成β-发夹模型的重要性，Why？β-发夹在β-折叠片形成中具有成核作用。单独β-发夹结构，不能稳定存在，形成分子间β-折叠片才能稳定。若能合成β-发夹模型肽，才能对β-折叠片中各种稳定因素进行研究。β-发夹模型的设计与合成研究发现，G蛋白B1结构域中的一个片段在水溶液中能够折叠成单体的天然β-发夹结构。根据这一发现，设计出了8个氨基酸残基组成的具有β-发夹结构的模型肽。β-发夹设计的关键：β-转角的设计，特别是选择合适的转角类型。第二十五页，共三十三页，编辑于2023年，星期一三级结构的设计设计思路：模仿天然蛋白质中较稳定的结构模块。设计较难，但已有多个成功的设计实例，如：Richardson等设计的全β蛋白质—著名的

betabellin（β-桶），由前后两个β-折叠组成，每个折叠由4股组成。

如：Goraj等设计的octarellin即(α/β)8。结构单元是turn-βstrand-turn-αhelix。构建的合成基因在E.coli中的表达

三级结构设计极为困难，为使结构更稳定，设计中常引入二硫键或金属离子。但Struthers等根据锌指结构成功地设计了一个23肽ββα三级结构，不含二硫键，也没有金属离子，其结构通过NMR检测证实。结构中同时包含了α-螺旋、β-折叠以及转角，全部使用天然氨基酸。其重要意义——是第一个全自动设计的蛋白质。

是迄今为止几个成功的三级结构设计实例之一。此外，Fedorov等还进行了自然界不存在的全新结构设计的尝试。在目前的设计中，CD谱计算的二级结构含量与目标基本相符，就算设计成功。正常折叠的问题第二十六页，共三十三页，编辑于2023年，星期一全新蛋白设计局限性（对结构和功能关系——认识不足）对一些结构简单、规律明显的蛋白质分子的设计。其中最著名的例子——四螺旋束和β-筒结构。四螺旋束和β-筒结构是自然界中广泛存在的结构类型，（稳定的结构）例如：在细胞色素、蚯蚓血红蛋白、烟草镶嵌病毒外壳蛋白等多种蛋白质都含有相连的四螺旋束。为什么要设计这些蛋白结构，具有什么特点？结构非常稳定，这些蛋白的同源性很小，具有相似的三维结构，因此，这些结构类型成为从头设计的目标。Degrado等设计的四螺旋束从头设计β结构简要介绍这两种结构科学研究的切入点和选材非常重要。第二十七页，共三十三页，编辑于2023年，星期一四螺旋束结构设计——蛋白质全新分子设计的“里程碑”

Degrado等（杜邦公司）设计合成的四螺旋束结构：4段螺旋的序列完全相同，各由16个氨基酸残基组成，螺旋之间的3段连接也完全相同，各由3个AA残基组成，共74个AA残基。。一级序列：

螺旋(helix):Gly-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Lys-Gly

连接(loop)：Pro-Arg-Arg

肽链：NH-Met-Helix-Ioop-Helix-Loop-Helix-Loop-Helix-COOH设计构想一级序列设计，着重选择了Leu、Lys和Glu三种残基。其中仅Leu为疏水残基，排布在螺旋内侧，Lys和Glu为带电荷残基，排布在螺旋外侧，螺旋的两端各加上1个Gly，中断螺旋，后面加上连接肽段。整个四螺旋束结构具有对称性。相邻螺旋反平行，螺旋轴夹角大约18度。疏水残基在内部，极性残基在表面，整个螺旋呈两性。这个设计实例被誉为蛋白质分子设计的“里程碑”Degrado等设计的四螺旋束第二十八页，共三十三页，编辑于2023年，星期一β折叠结构设计举例β喇叭筒状蛋白质由2个完全相同的β折叠片层组成，每一片层包含4条β-折叠股。前3条β折叠股各有8个残基，最后一条由7个残基，每一片层31个残基。设计思想：考虑到形成β折叠的倾向性以及肽链之间的相互作用，选择了Thr、Ser、Val、Leu、Ile和Ala等残基。Thr和Ser是极性残基，位于表面，以便与溶剂形成氢键；Val、Leu和Ile是疏水性残基，构成β形成体；Ala体积小，有利于内部堆积。残基位置排布，充分考虑了β链之间的成对效应，尽可能地安排疏水残基与疏水残基相对排列，带异性电荷的残基相对排列，带有大支链的残基与不带支链的残基相对排列，这样的排布使得在肽链之间产生最强的相互作用。两个片层依靠交联分子连接在一起，形成了一个筒状结构。从头设计β结构第二十九页，共三十三页，编辑于2023年，星期一三、蛋白质功能的全新设计模仿特定功能的结构域为基础 ——进行蛋白质功能的全新设计。蛋白质结构决定蛋白质的功能。因而蛋白质功能的设计也离不开蛋白质的结构特点，目前，以特定的结构域模拟天然蛋白质的功能。最终实现人工设计功能蛋白。

设计思路——举例第三十页，共三十三页，编辑于2023年，星期一螺旋—螺旋结构