第十章发光免疫技术

发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。

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第一节概述

当前第2页\共有47页\编于星期六\8点发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:光照发光、生物发光、化学发光等。

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光照发光（photoluminescence）是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。

生物发光（bioluminescence）是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。当前第4页\共有47页\编于星期六\8点

化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。一、化学发光当前第5页\共有47页\编于星期六\8点

一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下：A十BC*C*C＋h·γ其中γ为光子，C*表示C处于单线激发态。

当前第6页\共有47页\编于星期六\8点若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下：A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ当前第7页\共有47页\编于星期六\8点化学发光效率（φCL）决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（φCE）和激发态分子的发射效率（φEM）。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。二、化学发光效率当前第8页\共有47页\编于星期六\8点化学发光免疫分析目前分类按发光剂不同分为1.发光酶免疫测定技术（CLEIA）

2.化学发光免疫测定技术(CLIA)

3.电化学发光免疫测定技术(ECLIA)当前第9页\共有47页\编于星期六\8点第二节化学发光剂和标记技术当前第10页\共有47页\编于星期六\8点在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。

一、化学发光剂当前第11页\共有47页\编于星期六\8点能作为化学发光剂的条件：①发光的量子产率高；②它的物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；④其化学发光常是氧化反应的结果；⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。当前第12页\共有47页\编于星期六\8点㈠直接化学发光剂

直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。

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1.吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。

当前第14页\共有47页\编于星期六\8点2．三联吡啶钌

三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。三联吡啶钌当前第15页\共有47页\编于星期六\8点电化学发光剂反应原理

当前第16页\共有47页\编于星期六\8点㈡酶促反应发光剂：是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。1．鲁米诺及其衍生物

2．AMPPD当前第17页\共有47页\编于星期六\8点1．鲁米诺鲁米诺发光原理当前第18页\共有47页\编于星期六\8点鲁米诺增强发光反应原理当前第19页\共有47页\编于星期六\8点2．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕当前第20页\共有47页\编于星期六\8点1.碳二亚胺（EDC）缩合法

二、发光剂的标记技术C--O当前第21页\共有47页\编于星期六\8点2.过碘酸钠氧化法

当前第22页\共有47页\编于星期六\8点3．重氮盐偶联法当前第23页\共有47页\编于星期六\8点4.N-羟基琥珀酰亚胺活化法

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1．发光剂的选择2．被标记蛋白质的性质3．标记方法的选择4．原料比5．标记率6．温度7．纯化与保存影响标记的因素当前第25页\共有47页\编于星期六\8点第三节化学发光免疫分析的类型

当前第26页\共有47页\编于星期六\8点

用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。一、直接化学发光免疫分析当前第27页\共有47页\编于星期六\8点发光YYY磁微粒被测抗原+抗体+带丫啶酯标记物抗体YYYYYYYYYYY冲洗后---夹心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入碱（pH>10）直接化学发光的机理当前第28页\共有47页\编于星期六\8点磁微粒模式图YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特点抗原和抗体结合与未结合部分的易分离磁微粒技术当前第29页\共有47页\编于星期六\8点化学发光酶免疫分析（chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。二、化学发光酶免疫分析当前第30页\共有47页\编于星期六\8点该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。㈠辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析当前第31页\共有47页\编于星期六\8点辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图

当前第32页\共有47页\编于星期六\8点该分析系统以碱性磷酸酶标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。

㈡碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析当前第33页\共有47页\编于星期六\8点碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图

当前第34页\共有47页\编于星期六\8点分析步骤分配样品,磁颗粒和试剂孵育使反应物结合在磁场中清洗去除未结合物质加入底物产生信号孵育,促使信号的产生信号检测当前第35页\共有47页\编于星期六\8点电化学发光免疫分析（electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。

三、电化学发光免疫分析当前第36页\共有47页\编于星期六\8点电化学指在阳极表面[Ru(bpy)3]2+和TPA同时失去电子发生氧化反应。自由基TPA+●失去一个质子（H+），成为自由基TPA●，这是一个强还原剂。TPA●将一个电子递给Ru(bpy)33+，而TPA被氧化。激发态的Ru(bpy)32+*在衰减时发射一个波长为620nm的光子。化学发光包括当前第37页\共有47页\编于星期六\8点电化学发光免疫分析示意图当前第38页\共有47页\编于星期六\8点磁性微粒直径2.8µm，表面的凸凹使包被面积放大。磁性微粒体积小，悬浮于反应体系中，形成均一稳定的液相，在磁场中易于分离。当前第39页\共有47页\编于星期六\8点电化学发光免疫测定示意图当前第40页\共有47页\编于星期六\8点电化学发光免疫测定示意图当前第41页\共有47页\编于星期六\8点标记磁颗粒在电场中发光工作示意图当前第42页\共有47页\编于星期六\8点ECLIA体系结构图当前第43页\共