第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术

第一节发酵工业微生物菌种的选育一、工业微生物特点：个体小种类多繁殖快分布广代谢能力强易变异改造带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置当前第1页\共有146页\编于星期五\22点1、能在易得、价廉的原料制成的培养基上迅速生长，且代谢产物产量高。2、可以在要求不高、易于控制的培养条件下迅速生长和发酵；3、生长速度快，发酵周期较短。发酵周期短的优点在于感染杂菌的机会减少；提高设备的利用率。4、满足代谢控制的要求：根据代谢控制要求，选择单产高的营养缺陷型或调节突变株或野生突变株；5、抗噬菌体和杂菌能力强，不易被感染；6、菌种纯粹，遗传性状稳定（不易变异退化），以保证发酵生产和产品质量的稳定性。7、菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。二、发酵工业生产对菌种的要求当前第2页\共有146页\编于星期五\22点三、发酵工业用菌种的分离与筛选1、工业用菌种的来源：有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。经过诱变的菌株；通过DNA重组的工程菌；原生质体融合菌株。（一）微生物菌种分离当前第3页\共有146页\编于星期五\22点2、菌株分离（separation）和筛选（screening）定义分离和筛选就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌种纯化是指在特定环境中只让1种来自同一祖先的微生物群体生存的技术。菌株分离、筛选虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。当前第4页\共有146页\编于星期五\22点3、分离思路

新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。当前第5页\共有146页\编于星期五\22点定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。4、新种分离与筛选的步骤当前第6页\共有146页\编于星期五\22点菌种筛选主要步骤调查研究及查阅充分的资料设计实验方案确定采集样品的生态环境采样确定特定的增殖条件增殖培养确定特殊的选择培养基及可能的定性或半定量快速检出法平板分离原种斜面确定发酵培养基础条件筛选初筛（1株1瓶）复筛（1株3～5瓶）结合初步工艺条件摸索再复筛（1株3～5瓶）3～5株单株纯种分离生产性能试验、毒性试验菌种鉴定当前第7页\共有146页\编于星期五\22点（1）采样A、采样途径向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。总体来讲土壤样品的含菌量最多。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。当前第8页\共有146页\编于星期五\22点从自然界筛选当前第9页\共有146页\编于星期五\22点B、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。C、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。当前第10页\共有146页\编于星期五\22点（2）根据微生物生理特点采样A、根据微生物营养类型（局部环境）每种微生物对碳\氮源的需求不一样，分布也有差异。研究表明，微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。如：纤维素酶产生菌：森林土；蛋白酶和脂肪酶的产生菌：肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中；蛋白酶、糖化酶的菌株：在面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所；当前第11页\共有146页\编于星期五\22点以糖质为原料的酵母菌：通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中采样。果胶酶产生菌：柑橘、草莓及山芋等果蔬样品的腐烂部分及果园土；筛选代谢合成某种化合物的微生物：从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品；利用碳氢化合物为碳源的菌株：在油田附近的土壤。当前第12页\共有146页\编于星期五\22点筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样（极端环境）。如：高温酶产生菌：温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；低温酶产生菌：寒冷的地方，如南北极地区、冰窖、深海中采样；耐压菌：海洋底部采样。耐高渗透压酵母菌：通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖的耐高渗透压的酵母菌。当前第13页\共有146页\编于星期五\22点（3）含微生物样品的富集培养（优化的过程）

----施加选择性压力分离法收集到的样品，如含目标菌株较多，可直接进行分离。如果样品含目标菌种很少，就要设法增加该菌的数量，进行增殖(富集)培养。富集培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其它菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。定义：利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养要求的不同，如碳、氮源、pH、温度、渗透压、需氧等生理因素等，认为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其它种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势，而得以快速分离纯化的目的。当前第14页\共有146页\编于星期五\22点A、控制培养基的营养成分在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。如：筛选纤维素酶产生菌时，以纤维素作为唯一碳源进行增殖培养；分离耐高渗酵母菌：首先要到含糖分高的花蜜、糖质中去取样。富集培养基为5%～6%的麦牙汁，30%～40%葡萄糖，pH3～4，在20～25℃温度下进行培养，可以达到富集的目的。

当前第15页\共有146页\编于星期五\22点B、控制培养条件通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。如：细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.0～7.5），霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）。筛选极端微生物时，需针对其特殊的生理特性，设计适宜的培养条件，达到富集的目的。

当前第16页\共有146页\编于星期五\22点（4）微生物的纯种分离

尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。纯种分离方法常选用单菌落分离法。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。当前第17页\共有146页\编于星期五\22点A、稀释平皿分离法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀释纯种分离当前第18页\共有146页\编于星期五\22点稀释平皿分离法b.涂布平皿分离法a.倾注平皿分离法当前第19页\共有146页\编于星期五\22点a.连续划线分离法b.分区划线分离法B、平皿划线分离法当前第20页\共有146页\编于星期五\22点5、筛选方法

利用特殊的分离培养基对大量混杂微生物进行初步分离；采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。当前第21页\共有146页\编于星期五\22点在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。（1）透明圈法用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株

羧甲基纤维素钠作培养物当前第22页\共有146页\编于星期五\22点淀粉酶产生菌的分离：分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为惟一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株。有机酸产生菌的分离在选择性培养基中加入碳酸钙，使平板成混状，将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养，由于产生菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈，可以轻易地鉴别出来。分离乳酸产生菌时，由于乳酸是一种较强的有机酸，因此，在培养基中加入的碳酸钙不仅有鉴别作用，还有酸中和作用。

当前第23页\共有146页\编于星期五\22点对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。如：果胶酶产生菌的分离筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为惟一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。（2）变色圈法当前第24页\共有146页\编于星期五\22点谷氨酸产生菌的分离在分离谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，变色范围在pH6.2～7.6，当pH在6.2以下时为黄色，pH7.6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。脂肪酶产生菌的分离为提高分离筛选效率，多采用固体平板的变色圈法，以吐温为底物，尼罗蓝（Nileblue）作为指示剂，根据变色圈大小来判断脂肪酶活性的高低；也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明B为指示剂，以荧光圈的大小来测定。当前第25页\共有146页\编于星期五\22点生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围周围便会形成一个混浊的生长圈。如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌（如E.coliP264）与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。（3）生长圈法当前第26页\共有146页\编于星期五\22点针对某些微生物的产物对产生菌的筛选没有直接的选择性指示作用，常采用随机分离法进行分离常用于抗生素产生菌的分离筛选。抑菌圈法是常用的初筛方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。抗生素筛选（4）随机分离方法------抑菌圈法当前第27页\共有146页\编于星期五\22点6、生产性能的测定由于纯种分离后，得到的菌株数量非常大，如果对每一菌株都作全面或精确的性能测定，工作量十分巨大，而且是不必要的。一般采用两步法，即初筛和复筛，经过多次重复筛选，直到获得1～3株较好的菌株，供发酵条件的摸索和生产试验，进而作为育种的出发菌株。这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株，以区别于用人工育种方法得到的变异菌株（亦称突变株）。当前第28页\共有146页\编于星期五\22点7、毒性试验自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。当前第29页\共有146页\编于星期五\22点典型的微生物新种分离筛选过程当前第30页\共有146页\编于星期五\22点（二）微生物菌种的选育（育种）工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。选育目的：为生成提供各种类型的突变株大幅度提高菌种产生有价值代谢产物水平，还可以改进产品质量，去除不需要的代谢产物或产生新的代谢产物。当前第31页\共有146页\编于星期五\22点工业菌种育种的方法自然选育诱变选育抗噬菌体菌种的选育杂交育种原生质体融合技术基因工程技术当前第32页\共有146页\编于星期五\22点1、自然选育定义：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。目的：纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量。缺点：效率低方法：将菌种制成菌悬液，用稀释法在固体平板上分离单菌落，再分别测定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌种。当前第33页\共有146页\编于星期五\22点2、诱变育种以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。诱变育种：利用各种产生诱发突变的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。是目前国内外提高菌种产量、性能的主要手段。诱变方法：物理、化学或生物诱变方法（1）诱变育种原理：利用诱变处理方法导致基因突变。当前第34页\共有146页\编于星期五\22点

物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。（2）诱变剂和诱变处理当前第35页\共有146页\编于星期五\22点超净工作台小型X射线衍射仪Co60射线机当前第36页\共有146页\编于星期五\22点诱变剂诱变剂的剂量处理时间缓冲剂中止反应方法亚硝酸（HNO2）0.01～0.1mol/L5～10minpH值4.5，1mol/L醋酸缓冲液pH8.6，0.07磷酸二氢钠硫酸二乙酯（DES）0.5～1％10～30min，孢子18～24hpH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液硫代硫酸钠或大量稀释甲基磺酸乙酯（EMS）0.05～0.5mol/L10～60min，孢子3～6hpH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液硫代硫酸钠或大量稀释亚硝基胍（NTG）0.1～1.0mol/mL，孢子3mg/mL15～60min，90～120minpH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液或Tris缓冲液大量稀释亚硝基甲基胍（NMU）0.1～1.0mol/mL15～90minpH值6.0～7.0，0.1mol/L磷酸缓冲剂或Tris缓冲液大量稀释氮芥0.1～1.0mol/mL5～10minNaHCO3甘氨酸或大量稀释乙烯亚胺1:1000～1:1000030～60min

硫代硫酸钠或大量稀释羟胺（NH2OH∙HCl）0.1～0.5％数小时或生长过程中诱变

大量稀释氯化锂（LiCl）0.3～0.5％加入培养基中，在生长过程中诱变

大量稀释秋水仙碱（C22H25NO6）0.01～0.2％加入培养基中，在生长过程中诱变

大量稀释常用化学诱变剂诱变处理方法当前第37页\共有146页\编于星期五\22点大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射，设备费用大，并要注意安全性。大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。使用化学诱变剂的优缺点：当前第38页\共有146页\编于星期五\22点（3）诱变育种步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选当前第39页\共有146页\编于星期五\22点A、出发菌株的选择自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞：有的作用于休止期，就可选用孢子。当前第40页\共有146页\编于星期五\22点

B、处理菌悬液的制备这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。带玻璃珠的三角瓶内，加无菌水当前第41页\共有146页\编于星期五\22点C、诱变处理诱变剂的选择遗传不稳定的菌株，采用温和的诱变剂，或采用已见效果的诱变剂；遗传上较稳定的菌株则采用强烈的、不常用的、诱变谱广的诱变剂。不应常采用同一种诱变剂反复处理，以防止诱变效应饱和；但也不要频频变换诱变剂，以避免造成菌种的遗传背景复杂，不利于高产菌株的稳定。考虑诱变剂本身的特点。例如紫外线主要作用于DNA分子的嘧啶碱基，而亚硝酸则主要作用于DNA分子的嘌呤碱基。紫外线和亚硝酸复合使用，突变谱宽，诱变效果好。当前第42页\共有146页\编于星期五\22点②诱变条件的选择仅仅采用诱变剂的理化指标控制诱变剂的用量常会造成偏差，不利于重复操作。例如：同样功率的紫外线照射诱变效应还受到紫外灯质量及其预热时间、灯与被照射物的距离、照射时间、菌悬液的浓度、厚度及其均匀程度等诸多因素的影响。另外，不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率表示诱变剂造成菌悬液中死亡菌体数占菌体总数的比率。当前第43页\共有146页\编于星期五\22点③诱变剂剂量的确定诱变处理剂量的选择是一个比较复杂的问题，一般正突变较多出现在偏低剂量中，而负突变则较多地出现于偏高剂量中。对于经过多次诱变而提高了产量的菌株，在较高剂量负突变率更高。因此，目前处理量已从以前采用的死亡率90％～99％减低为死亡率70％～80％。当前第44页\共有146页\编于星期五\22点B.megateriumMPF-906的致死率曲线当前第45页\共有146页\编于星期五\22点④复合诱变诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用，也可用同一诱变剂重复使用。因为每种诱变剂有各自的作用方式，引起的变异有局限性，复合处理则可扩大突变的位点范围，使获得正突变菌株的可能性增大，因此，诱变剂复合处理的效果往往好于单独处理。当前第46页\共有146页\编于星期五\22点

D、中间培养由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。此过程称为中间培养。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。方法：让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。当前第47页\共有146页\编于星期五\22点D、分离和筛选筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异。

当前第48页\共有146页\编于星期五\22点初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。摇床复筛降解纤维素产生产透明圈病毒产生产空斑当前第49页\共有146页\编于星期五\22点实例1：紫外线的诱变育种紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。当前第50页\共有146页\编于星期五\22点被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个/ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。当前第51页\共有146页\编于星期五\22点（1）将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。（2）将菌悬液放入一已灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。（3）取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。

操作步骤当前第52页\共有146页\编于星期五\22点（4）取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。（5）取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。（6）取中间培养液稀释分离、培养。（7）挑取菌落进行筛选。当前第53页\共有146页\编于星期五\22点实例2：亚硝基胍诱变曲霉菌

N—甲基—N'-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。当前第54页\共有146页\编于星期五\22点（1）单孢子悬液制备取斜面，加入6ml0.1mol／LpH6.0的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，立即通过带滤纸漏斗过滤，由此制得单孢子悬液，若孢子液浑浊状，其孢子浓度可达l06个／ml，此为待处理孢子悬液。（2）MNNG溶液的制备用分析天平称取2mg，加入2ml0.1mol／LpH6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。操作步骤当前第55页\共有146页\编于星期五\22点（3）诱变处理吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子悬液中，30℃振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，30℃3天后计数。（4）死亡率计算将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离，30℃下培养3天。根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。（5）挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选．当前第56页\共有146页\编于星期五\22点3、基因育种基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另—个细胞的方法。当前第57页\共有146页\编于星期五\22点一个完整的基因克隆过程包括以下步骤（1）获得待克隆的DNA片段（基因）；（2）目的基因与载体在体外连接；（3）重组DNA分子导入宿主细胞；（4）筛选、鉴定阳性重组子；（5）重组子的扩增与／或表达。当前第58页\共有146页\编于星期五\22点当前第59页\共有146页\编于星期五\22点4、原生质体育种定义：通过酶解作用将两个亲株的细胞壁去除，在高渗条件下释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，将两个亲株的原生质体在高渗条件下进行混合，加入融合促进剂聚乙二醇、仙台病毒或电融合等助融，使他们相互凝集。通过细胞质融合，促使两套基因组之间的接触、交换、遗传重组，在适宜的条件下使细胞壁再生，在再生的细胞中获得重组体。原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，原生质体诱变育种等。原生质体融合一般包括标记菌株的筛选、原生质体的制备、原生质体的融合、融合子的选择、实用性菌株的筛选等。当前第60页\共有146页\编于星期五\22点

（1）原生质体融合育种的特点杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。、存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。提高菌株产量的潜力较大。有助于建立工业微生物转化体系。当前第61页\共有146页\编于星期五\22点（2）原生质体融合育种步骤标记菌株的筛选和稳定性验证。原生质体制备。等量原生质体加聚乙二醇促进融合。涂布于再生培养基，再生出菌落。选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。生产性能筛选。当前第62页\共有146页\编于星期五\22点原生质体融合的基本过程当前第63页\共有146页\编于星期五\22点（3）原生质体融合育种的要点标记菌种的选择获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。当前第64页\共有146页\编于星期五\22点原生质体的制备：原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。放线菌和细菌制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。有时需结合其它一些措施，如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性。

当前第65页\共有146页\编于星期五\22点对于不同微生物，原生质体的高渗稳定液组成也是不同的。如：细菌的稳定液常用SMM液(用于芽孢杆菌原生质体制备和融合，其主要成分是蔗糖0.5M，顺丁烯二酸0.02M，MgCl20.02M)和DF液(用于棒状杆菌原生质体制备和融合，主要成分是蔗糖0.25M，琥珀酸0.25M，EDTA0.001M，K2HPO40.02M，KH2PO40.11M，MgCl20.01M)。在链霉菌中用得较多的是P液(主要成分蔗糖0.3M，MgCl20.01M，CaCl20.25M及少量磷酸盐和无机离子)。真菌中广为使用的是0.7MNaCl或0.6MMgSO4溶液，高渗稳定液使原生质体内空泡增大，浮力增加，易与菌丝碎片分开。当前第66页\共有146页\编于星期五\22点

影响原生质体制备的因素菌体的前处理：为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。菌体的培养时间：为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体。酶浓度：对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。另外，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。当前第67页\共有146页\编于星期五\22点酶处理温度破壁时的pH值渗透压稳定剂等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。稳定剂的使用浓度一般为0.3～0.8mol／L。当前第68页\共有146页\编于星期五\22点微生物细胞壁主要成分去壁方法革兰氏阳性菌

芽孢杆菌

葡萄球菌

链霉菌小单胞菌肽聚糖溶菌酶处理溶葡萄球菌素处理溶菌酶处理(菌丝生长时补充0.5～5.0%甘氨酸或10～34%蔗糖)溶菌酶处理(菌丝生长时补充0.2～0.5%甘氨酸)革兰氏阴性菌

大肠杆菌碱性普罗委登斯菌

黄色短杆菌肽聚糖和脂多糖溶菌酶和EDTA处理溶菌酶和EDTA处理溶菌酶处理(生长时补充0.41M蔗糖及0.3u/ml青霉素)霉菌纤维素和几丁质纤维素酶或真菌中分离的溶壁酶酵母菌葡聚糖和几丁质蜗牛酶一些微生物的去壁方法当前第69页\共有146页\编于星期五\22点（4）原生质体的融合影响原生质体融合的因素不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，甚至一些非常接近的种，最适再生条件也往往有所差别；再生培养基成分及培养温度。最重要的一个共同点是都需要高渗透压。能再生细胞壁的原生质体只占总量的一部分。细菌一般再生率为3-10%。有资料报道，在再生培养基中添加牛血清白蛋白，可使枯草杆菌原生质体的再生率达100%。真菌再生率一般在20-80%。链霉菌再生率最高可达50%。菌体的前处理、菌体的培养时间；融合剂的浓度、融合剂作用的时间；阳离子的浓度、融合的温度及体系的pH值等。

当前第70页\共有146页\编于星期五\22点（5）原生质体再生原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。影响原生质体再生的因素有：菌种自身的再生性能、原生质体制备的条件、再生培养基成分、再生培养条件等。

当前第71页\共有146页\编于星期五\22点（6）检查原生质体形成和再生的指标原生质体形成率和再生率：将用酶处理前的菌体经无菌水系列稀释，涂布于完全培养基平板上培养，计出原菌数，设该数值为A。将用酶处理后得到原生质体分别经如下两个过程的处理。用无菌水适当稀释，在完全培养基平板上培养计数，由于原生质体在低渗透压条件下会破裂失活，所以生长出的菌落数为未形成原生质体的原菌数，设该值为B。用高渗透压液适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出的菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和，设该数值为C。以原生质体形成率和再生率为指标，可确定原生质体制备最佳条件。当前第72页\共有146页\编于星期五\22点（7）筛选优良性状融合重组子重组子的检出方法有两种：直接法和间接法。直接法将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出重组子；间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。由于原生质体融合后会产生两种情况：一种是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体，较稳定遗传；另一种是暂时的融合，形成异核体。不稳定，会分离成亲本类型，有的甚至可以异核状态移接几代。因此，要获得真正融合子，必须在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定。当前第73页\共有146页\编于星期五\22点5、新型微生物育种技术（1）离子注入法（2）激光诱变技术（3）微波育种技术（4）Genomeshuffling（基因组重排）技术当前第74页\共有146页\编于星期五\22点（1）离子注入法离子注入法是利用离子注入设备产生高能离子束(40-60kev)并注入生物体引起遗传物质的永久改变，然后从变异菌株中选育优良菌株的方法。离子注入装置—离子注入机：由离子源、质量分析器、加速器、四极透镜、扫描系统和靶室组成，可以根据实际需要省去次要部位。离子源是离子注入机的主要部件，作用是把需要注入的元素电离成离子，决定注入离子的种类和束流强度。当前第75页\共有146页\编于星期五\22点H+、N+、Ar+离子是常用的诱变剂，其中N+最常用。注入能量为20kev-30kev，注入剂量0(对照)-1016ion/cm2之间，脉冲式注入，每次连续注入的时间和间隔时间因处理的种类不同而各异，温度应控制50℃以下，真空度为10-3Pa。这只是常用量，针对不同菌种要进行适当的调节。1996年，离子束诱变用于右旋糖酐产生菌，得到产量提高3615%的突变株。当前第76页\共有146页\编于星期五\22点（2）激光诱变技术国内外进行激光诱变的激光器有多种，波长从远红外11818μm、1016μm到可见光694.4nm、632.8nm、530nm、441.6nm至紫外线337.1nm、265nm。几乎所有频率的激光都有诱导的效果，照射剂量一般采用1-50J/cm2，处理时间可以缩短到秒，也可以延长至数小时不等。常用的激光器有CO2、He-Ne、N分子、铵玻璃、红宝石Ar+和YAG等。其中以CO2和He-Ne激光器最为常用。当前第77页\共有146页\编于星期五\22点激光诱变机理：国内外普遍认同的解释是在激光辐照机体时产生光照活化效应，使核仁器抑制解除而被活化；使DNA、RNA和蛋白质系统活性提高，核糖体上蛋白质合成作用的活性增强，使机体内的生物合成增强，特别是三羧酸酶和细胞色素氧化酶活性提高，从而提高细胞利用氧的能力并增强细胞合成ATP的能力。当前第78页\共有146页\编于星期五\22点大量的试验资料表明，激光育种是一种行之有效的育种新技术。如：华侨大学彭益强与张文珍教授，利用激光诱变成功筛选出高产植酸酶黑曲霉菌株“ASP2L211”，比原始菌株的植酸酶活力提高了3.75倍。浙江省微生物所吴振倡采用铜蒸气激光选育成“天兰红链霉菌”及其原生质体再生菌，其发酵单位，比出发菌株产量提高12.9%-14.4%，已推广应用。当前第79页\共有146页\编于星期五\22点（3）微波育种技术微波辐射属于一种低能电磁辐射，具有较强生物效应的频率范围在300MHz-300GHz，对生物体内有热效应和非热效应。其热效应是指它能引起生物体局部温度上升，从而引起生理生化反应，非热效应指在微波作用下，生物体会产生非温度关联的各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下，生物体会产生一系列突变效应。当前第80页\共有146页\编于星期五\22点微波辐射属于一种低能电磁辐射，具有较强生物效应的频率范围在300MHz-300GHz，对生物体内有热效应和非热效应。其热效应是指它能引起生物体局部温度上升，从而引起生理生化反应，非热效应指在微波作用下，生物体会产生非温度关联的各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下，生物体会产生一系列突变效应。当前第81页\共有146页\编于星期五\22点4.Genomeshuffling技术Genomeshuffling(基因组改组，也有人称为“基因组重排”)技术是微生物育种的新技术，也是各国争相研究的新技术。Genomeshuffling只需在进行首轮改组之前，通过经典诱变技术获得初始突变株，然后将包含若干正突变的突变株作为第一轮原生质体融合的出发菌株，此后经过递推式的多轮融合，最终使引起正性突变的不同基因重组到同一个细胞株中。当前第82页\共有146页\编于星期五\22点基因组改组技术的重组对象是整个基因组，可以同时在整个基因组的不同位点重组，将多个亲本的优良表型通过多轮的重组集中于同一株菌株，不必了解整个基因组的序列数据和代谢网的信息。与经典的诱变方法相比，基因组改组技术可以快速、高效地筛选出优良菌株，而且这些菌株集多种正突变于一体，因此在很大程度上弥补了经典诱变方法的缺陷。当前第83页\共有146页\编于星期五\22点第二节菌种保藏与复壮

菌种是一种极其重要和珍贵的生物资源，菌种保藏的意义在于保持保持优良菌种的优良性状的稳定，提高菌种的存活率，减少菌种的变异，满足生产的实际需要这对于成功的工业发酵过程极为重要。菌种保藏原理：根据菌种的生理生化特点，人为创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。当前第84页\共有146页\编于星期五\22点理想的菌种保藏方法应具备的条件经长期保藏后菌种存活健在。保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。当前第85页\共有146页\编于星期五\22点一、微生物菌种保藏在一定时间内使菌种不死、不变、稳定基本要求：基本方法：生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥当前第86页\共有146页\编于星期五\22点

由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。

对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。当前第87页\共有146页\编于星期五\22点二、国际重要菌种保藏机构当前第88页\共有146页\编于星期五\22点三、中国菌种保藏单位当前第89页\共有146页\编于星期五\22点四、工业微生物菌种保藏技术(1)超低温或在液氮中冷冻保藏；(2)冷冻干燥或真空干燥保藏(3)

转接培养或斜面传代保藏；(4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。当前第90页\共有146页\编于星期五\22点菌种保藏方法暂时保藏法

斜面传代法穿刺法长期保藏法

液体石蜡法甘油管法砂管保藏法砂土管保藏法滤纸片保藏法冷冻干燥保藏法液氮冷冻法

当前第91页\共有146页\编于星期五\22点(一）低温定期移植法将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的传代保藏方法。可用于实验室中若干菌种的保藏。特点：此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。原理：保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置4C˚冰箱中存放，定期进行传代培养、再存放。可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。当前第92页\共有146页\编于星期五\22点将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C˚冰箱中包藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。（4℃菌种不能休眠，仅是抑制微生物的生命活动）

1、斜面保藏法当前第93页\共有146页\编于星期五\22点2、穿刺保藏法将含0.6-0.8%的琼脂培养基装试管灭菌，直立冷凝后，用接种针尖挑去少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养，待培养好后用胶塞封严，置4℃冰箱存放。缺点：易发生遗传变异；连续传代可使一些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂菌。贵重菌株及优良菌株不易用此法。当前第94页\共有146页\编于星期五\22点原理：将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，使菌种与空气隔绝，菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还可防止水分蒸发，在低温下达到较长期保藏菌种的目的。保藏温度要求在-4℃-4℃，适用于不产孢子的菌种。方法：斜面菌种，纯净优质石蜡油置三角瓶121℃灭菌1-2h，放入烘箱中（160℃）干热处理，待石蜡油清澈透明后加入斜面，其用量以高出斜面顶端1CM为准。将试管直立，置低温下保存。特点：此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通细菌也可保藏1年左右。3、液体石蜡保藏法当前第95页\共有146页\编于星期五\22点以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株2～3年也应做一次存活试验。当前第96页\共有146页\编于星期五\22点（二）冷冻保藏法

冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻保藏种类普通冷冻保藏技术(-20℃)超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)液氮冷冻保藏技术当前第97页\共有146页\编于星期五\22点1、普通冷冻保藏技术(-20℃)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。当前第98页\共有146页\编于星期五\22点2、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。

当前第99页\共有146页\编于星期五\22点3、液氮冷冻保藏技术

特点：目前广泛应用的菌种长期保藏方法，适用于大多数微生物的保藏原理：微生物在-130℃以下温度时，其新陈代谢作用停止，化学反应消失，液氮温度-196℃，这种条件下可长期保藏菌种。冷冻保护剂在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。其次根据菌种不同还可选用葡萄糖、蔗糖、PVP、乳糖、脱脂乳粉作为抗冻剂。当前第100页\共有146页\编于星期五\22点待冷冻保藏菌种悬液的制备从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。

液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤当前第101页\共有146页\编于星期五\22点将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)；补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度达-50℃；将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-156℃)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。控速冷冻当前第102页\共有146页\编于星期五\22点从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解冻；用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml(约4、8滴)转接入琼脂斜面上。复苏当前第103页\共有146页\编于星期五\22点（三）干燥保藏法（载体法）实验原理：使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。当前第104页\共有146页\编于星期五\22点1、砂土管保藏法河砂处理取河砂若干加入盐酸10%，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。土壤处理取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。砂土混合处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常采用间歇灭菌2--3次)，最后烘干。当前第105页\共有146页\编于星期五\22点2、滤纸保藏法将保藏的微生物细胞或孢子吸附在灭菌滤纸上，干燥后保藏。方法：将3#滤纸剪成5mm*50mm的小纸条放入干燥飞培养皿中灭菌。将培养好的菌种用灭菌脱脂乳或乳粉复原乳制成孢子悬液，用灭菌镊子将准备好的滤纸条在灭菌操作条件下加入菌悬液中，充分吸附菌孢子，取出后放入灭菌小试管或安瓿瓶中，在真空干燥机上抽干，真空条件下火焰熔封、冷藏。当前第106页\共有146页\编于星期五\22点3、冻干保藏

冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。当前第107页\共有146页\编于星期五\22点（1）培养物的冻干过程当前第108页\共有146页\编于星期五\22点（2）冷冻真空干燥操作流程安培瓶配制保护剂灭菌菌种培养制备菌悬液分装安培瓶洗净烘干装标签加棉塞预冻真空干燥测定水分熔封管口检查真空度保藏当前第109页\共有146页\编于星期五\22点（3）冻干菌种的保藏与再生保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5℃下保藏。较低的保藏温度(-20～-70℃)对于培养物的长期稳定更好。复苏：在超净工作台中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿。在安瓿中加入0.5～1ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l～2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5～l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。当前第110页\共有146页\编于星期五\22点4、基因工程菌的保藏由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。当前第111页\共有146页\编于星期五\22点不同菌种保藏方法比较当前第112页\共有146页\编于星期五\22点5、微生物活力和稳定性测定

所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。当前第113页\共有146页\编于星期五\22点加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的稳定性。在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括：在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)、细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品的稳定性，后者极为重要。当前第114页\共有146页\编于星期五\22点五、

菌种的退化（衰退）与复壮

在生物进化的历史长河中，遗传性的变异是绝对的，而它的稳定性反而是相对的；退化性的变异是大量的，而进化性的变异却是个别的。在自然情况下，个别的适应性变异通过自然选择就可保存和发展，最后成为进化的方向；在人为条件下，人们也可以通过人工选择法去有意识地筛选出个别的正变体用于生产实践中。相反，如不自觉、认真地去进行人工选择，大量的自发突变菌株就会趁机泛滥，最后导致菌种的衰退（degeneration）。

当前第115页\共有146页\编于星期五\22点在长期接触菌种的实际工作人员中，都有这样的体会，即如果对菌种工作长期放任自流，不搞纯化、复壮（rejuve-nation）和育种，则菌种就会对你进行“惩罚”，反映到生产上就会出现持续的低产、不稳产。这说明菌种的生产性状也是不进则退的。当前第116页\共有146页\编于星期五\22点菌种退化：指在长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。1、

菌种的退化

当前第117页\共有146页\编于星期五\22点（1）菌种衰退的表现对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。其他原有的典型性状变得不典型时，也是衰退。最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变。生长速度缓慢，产孢子越来越少。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降。抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱等。当前第118页\共有146页\编于星期五\22点（2）菌种衰退的原因（A）基因突变:有关基因的负突变。控制产量基因突变控制孢子生成突变优良性状的回复突变。（B）变异菌株性状分离菌株优良性状不稳定，在筛选或者传代中逐步丢失和衰退。当前第119页\共有146页\编于星期五\22点（C）连续传代：（D）其它因素T、RH、培养基成分等培养条件引起的基因突变。当前第120页\共有146页\编于星期五\22点（3）菌种衰退的实质菌种的衰退是发生在细胞群体中的一个由量变到质变的逐步演变过程。开始时，在一个大群体中仅个别细胞发生负变，这时如不及时发现并采取有效措施，而一味移种传代，则群体中这种负变个体的比例逐步增大，最后让它们占了优势，从而使整个群体表现出严重的衰退。所以，在开始时所谓“纯”的菌株，实际上其中已包含着一定程度的不纯因素；同样，到了后来，整个菌种虽已“衰退”了，但也是不纯的，即其中还有少数尚未衰退的个体存在着。当前第121页\共有146页\编于星期五\22点（4）防止菌种衰退的方法（A）控制传代次数:斜面移植一代：霉菌、芽孢杆菌、放线菌低温保藏半年；酵母保藏3个月；无芽孢细菌1个月。（B）选择合适的培养条件：一个适合原种的生长条件，就可在一定程度上防止菌种衰退。如改变培养基成分、改变培养温度等（C）利用不同类型的细胞进行传代：对于霉菌和放线菌，利用孢子接种传代，可防止衰退，利用菌丝接种传代易出现衰退和不纯的子代。（D）选择合适的保藏方法：保藏方法的选择和优化当前第122页\共有146页\编于星期五\22点2、菌种的复壮（1）复壮的概念：使衰退的菌种重新恢复原来的优良性状。狭义的复壮仅是一种消极的措施，它指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的一种措施；而广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。所以，这实际上是一种利用自发突变（正变）不断从生产中进行选种的工作。

当前第123页\共有146页\编于星期五\22点从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。纯种分离通过寄主体进行复壮（对于寄生性微生物的退化菌株，可通过接种到相应昆虫或动物寄主体内以提高菌株毒性。如经过长期人工培养的杀螟杆菌，会发生毒力减退、杀虫率降低等现象，这时可将退化的菌株去感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离菌株。如此反复多次，就可提高菌株的杀虫率）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。（2）菌种复壮方法：当前第124页\共有146页\编于星期五\22点（2）菌种复壮方法

纯种分离：通过纯种分离，可把退化菌种的细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经过扩大培养，就可恢复原菌株的典型性状。

当前第125页\共有146页\编于星期五\22点通过宿主体内生长进行复壮。对于寄生性微生物的退化菌株，可通过接种至相应的昆虫或动、植物宿主体内的措施来提高它们的致病性。淘汰已衰退的个体，如低温抗性筛选。当前第126页\共有146页\编于星期五\22点第三节工业微生物种子的扩大培养种子扩大培养的目的与要求种子制备实例种子制备的技术概要当前第127页\共有146页\编于星期五\22点种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。一、种子扩大培养的目的与要求1、种子扩大培养的概念:当前第128页\共有146页\编于星期五\22点2、种子扩大培养的方法:

液体培养法：包括液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养。摇瓶通气量大小与摇瓶机型式、转数、振程(或偏心距)、三角瓶容量、装料量有关。表面培养法：包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。固体培养法：包括三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养。当前第129页\共有146页\编于星期五\22点