免疫病原微生物学进展

沙门氏菌研究进展

Lecture4一概述

沙门氏菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌统称为沙门氏杆菌。1880年Eberth首先发现伤寒杆菌，1885年Salmon分离到猪霍乱杆菌，由于Salmon发现本属细菌的时间较早，在研究中的贡献较大，遂定名为沙门氏菌属。目前至少有67种O抗原和2000个以上血清型，所致疾病称沙门氏菌病。分类地位Taxonomicposition命名NomenclatureGenus(italics)Salmonella

Species(italics)enterica,whichincludessubspeciesI,II,IIIa,IIIb,IV,andVIbongori(formerlysubspeciesV)Serotype(capitalized,notitalicized)b

Thefirsttimeaserotypeismentionedinthetext;thenameshouldbeprecededbytheword"serotype"or"ser."SerotypesarenamedinsubspeciesIanddesignatedby

antigenicformulaeinsubspeciesIItoIV,andVIandS.

bongori

MembersofsubspeciesII,IV,andVIandS.

bongoriretaintheirnamesifnamedbefore1966TABLE1.

SalmonellanomenclatureinuseatCDC,2000a

aIn1984Farmeretal.(10)updatedthereportingsystemusedatCDCforSalmonella.ThemajorchangesthatCDCmadeandthatresultinadifferencefromthe1984reportingsystemare(i)capitalizationoftheserotypename,(ii)inclusionofsubspeciesVIandS.

bongori,and(iii)adoptionofthetypespeciesnameS.

enterica.bExamplesofserotypedesignationsareSalmonellaserotype(ser.)Typhimurium,SalmonellaII50:b:z6,SalmonellaIIIb60:k:z,andSalmonellaser.Marina(IV48:g,z51:).

（一）生物学性状

1、形态与染色

大小0.6～1.0×2～3um，无芽胞，一般有鞭毛，无荚膜，多数有菌毛，革兰氏阴性杆菌。

2、培养特性

兼性厌氧菌，在普通琼脂平板上形成中等大小、半透明的S型菌落。在肠道杆菌选择性培养基上形成无色菌落。

培养基观察结果特性EMB(伊红美蓝琼脂)菌落为无色不发酵乳糖MCA（麦康凯培养基）菌落为无色不发酵乳糖Phenolredlactosebroth培养基呈红色(—)不发酵乳糖Phenolredsaccharosebroth培养基呈紅色(—)不发酵蔗糖Phenolreddextrosebroth培养基呈黃色，发酵管中有气体(A/G)发酵葡萄糖并产气Starchagarplate滴加碘液后不产生clearzone(—)无胞外淀粉水解酶Nutrientgelatindeeptube培养基培养后放入冰箱中呈固态(—)无胞外动物凝胶水解TSIagarslant斜面紅色，底部黃色，培养基断裂成两段发酵葡萄糖并且产生气体和H2SSIMagar(0.3％agar)培养基有黑色沉淀物且扩散至接种线外产生H2S且具运动性Trypticasesoyagarslant培养后滴入H2O2有气泡产生（＋）有H2O2酶可分解H2O2且非绝对厌氧菌IMViC（培养基颜色）I黃色（-）

M红色（+）

V上层不变色（-）

C蓝色有菌生长（+）

不分解色氨酸故不形成吲哚;但发酵葡萄糖，并保持酸性;可利用柠檬酸盐为碳源

Ureabroth无桃紅色产生

尿素酶Urease來分解

3、生化反应表3沙门氏菌种、亚种、血清型及其主要宿主（Kauffmann-Whiteschemea）

沙门氏菌种和亚种Salmonellaspeciesandsubspecies亚种中存在的血清型数目No.ofserotypeswithinsubspecies主要宿主Usualhabitat种亚种肠道沙门氏菌S．erterica

SubspeciesIsubspeciesenterica肠道亚种1,454温血动物

SubspeciesIIsubspeciessalamae萨拉姆亚种489冷血动物和环境b

SubspeciesIIIasubspeciesarizonae亚利桑那亚种94SubspeciesIIIbsubspeciesdiarizonae双相亚利桑那亚种324SubspeciesIVSubspecieshoutenae豪顿沙门氏菌70SubspeciesVIsubspeciesindica因迪卡沙门氏菌12邦戈尔沙门氏菌S.bongori

S.bongori(V)20Total2463aTheKauffmann-WhiteschemehasbeendescribedelsewherebIsolatesofallspeciesandsubspecieshaveoccurredinhumans.

表4沙门氏菌种和亚种之间生化特征区别种S.entericaS.bongori亚种Enterica肠炎Salamae萨拉姆

Arizonae亚利桑那Diariaonae双亚利桑那Houtenae豪顿Indica印度反应卫矛醇++---d+ONPG（2h）--++-d+丙二酸-+++---明胶酶-+++++-山梨醇+++++-+KCN----+-+L(+)-酒石酸盐+----

半乳糖醛酸-+-++++γ-谷氨酰转肽酶+(*)+-++++β-葡糖苷酸酶dd-+-d-粘液酸+++-(70%)-++水杨苷----+--乳糖---(75%)+(75%)-d-O1噬菌体裂解++-+-+d根据DNA亲缘关系分类DNA杂交研究证明几乎所有的沙门氏菌的DNA同源性都极为一致，也就是几乎所有的亚属都属于同一个种(有亚属V是个例外)。所以现在分类学上确认的沙门氏菌只有两个种:S.enteritid、和S.bongori目前最新的沙门氏菌抗原表最新抗原表中共收录沙门氏菌2463个血清型。抗原表中将沙门氏菌分为两个种七个亚种:S.enterica(该种又分为6个亚种:S.entericasubsp.enterica，

S.entericasubsp.salanuze，

S.enterica.subsp.arizonae，

S.enterica.subsp.diarizonaze，

S.entericesubsp.houtenae，

S.entericasubsp.indicaS.bongori二、基因组研究进展2001年十月的《自然》杂志发表了肠道沙门氏菌两种变体的完整基因组序列。ServovarTyphi(或S.typhi)是伤寒的致病原因，serovarTyphimuriumLT2(S.typhimurium)可让人患肠胃炎。将这两个序列彼此比较、并与埃希氏杆菌(E.coli)的基因组序列进行比较，让研究人员了解到了涉及多药物抗性的质粒和与鼠疫病原体耶尔森氏鼠疫杆菌的质粒具有很大程度的相似性的一种致病质粒的详细情况.

WebLink

StrainsSequencedMicrobialGenomesatNCBISalmonellaentericasv.TyphimuriumLT2;Salmonellaentericasv.TyphiCT18BacterialGenomesatGenomeSequencingCenter,WashingtonUniversitySalmonellaentericasv.TyphimuriumLT2;Salmonellaentericasv.ParatyphiA;KlebsiellapneumoniaeMGH78578SangerCentre,UKSalmonellaentericasv.TyphiCT18UniversityofIllinoisSalmonellaentericasv.Pullorum;

Salmonellaentericasv.Enteritidis;Salmonellaentericasv.DublinFig1CircularrepresentationoftheS.typhigenome.Theouterscaleismarkedinmegabases.Circlesrangefrom1(outercircle)to9(innercircle).Circles1and2,genesonforwardandreversestrand;circles3and4,genesconservedwithE.coli;circles5and6,genesuniquetoS.typhiwithrespecttoE.coli;circle7,pseudogenes;circle8,G+Ccontent;circle9,GCbias((G-C/G+C);khaki（黄褐色）indicatesvalues>1;purple<1).Allgenesarecolour-codedbyfunction:darkblue,pathogenicity/adaptation;black,energymetabolism;red,informationtransfer;darkgreen,membranes/surfacestructures;cyan（蓝绿色）,degradationofmacromolecules;purple,degradationofsmall

molecules;yellow,central/intermediarymetabolism;lightblue,regulators;pink,phage/ISelements;orange,conservedhypothetical;palegreen,unknownfunction;brown,pseudogenes©

Nature

S.typhi(CT18)thatisresistanttomultipledrugsGenome4,809,037-basepair(bp)PseudogenesovertwohundredplasmidpHCM1218,150-bp（multiple-drug-resistance）

pHCM2（cryptic）106,516-bp（recentcommonancestrywithavirulenceplasmidofYersinia）三、沙门氏菌的毒力和耐药基因1、沙门氏菌毒力基因

spv基因沙门氏菌毒力岛沙门氏菌spv基因沙门氏菌可在宿主的巨噬细胞内存活和繁殖，这一特点对其发生严重全身感染极为关键。在能引起严重感染的非伤寒沙门氏菌中，普遍存在一个大小约50-90kb的质粒，该质粒与沙门氏菌的毒力表型密切相关，因此称其为spv（SalmonellaPlasmidVirulence）。在不同血清型沙门氏菌（伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡沙门氏菌）菌株中，都分离到不同分子量、基因组成不同的大质粒，但它们均含有一段高度保守的约8kb的spv基因，spv基因编码的产物和细菌的毒力表型关系最为密切。Fig2GeneticorganizationofthevirulenceplasmidsofseveralserovarsofSalmonella.ThealignmentofthemapsofS.dublinandS.gallinarumplasmidsistentative[31,46].Thepar,spvandtraregionsareshownindetailabovetheS.enteritidisplasmidmap.TheS.enteritidisplasmiddiffersfromtheS.typhimuriumplasmidbyonlytwodeletions,thelocationandestimatedsizesofwhichareindicated(blacktriangles).Inturn,thedeletionsdetectedinthetraregionoftheS.enteritidisplasmidwithrespecttotheFplasmidareshownaswhitetriangles[12,44].Restriction-siteabbreviationsareasfollows:H,HindIII;S,SalI;X,XhoI;Xb,XbaI1OtherserovarsofSalmonellathatcouldalsobearvirulenceplasmids,asdeducedfromhybridizationexperiments,areS.johannesburg,S.kottbus,S.give,S.newportandS.derby。2S.gallinarumandS.pullorumarebiovarsofthesameserovars.SerovarHostDiseasePlasmid(kb)S.paratyphiCHumansParatyphoidfever54S.enteritidisRodentsMurinetyphoid60S.typhimuriumRodentsMurinetyphoid90S.dublinCattleSepticemicdisease80S.choleraesuisPigsSepticemicdisease50S.gallinarum2

PoultryFowltyphoid85S.pullorum2

PoultryPullorumdisease85S.AbortusovisSheepAbortion50–67

表5Salmonellaserovarscarryingvirulenceplasmids1.1、spv的结构（Spv基因由6个开放阅读框（ORF））正性调控基因spvR:编码Lys/metR家族转录活化因子的细菌调节性蛋白，并使spv基因按照spvABCD的方向进行转录4个效应基因:

编码产物

spvA:28.2kDa的蛋白质

spvB:65kDa的单链多肽

spvC:28kDa的蛋白质

spvD:24.8kDa的蛋白质

ORFE:位于5个基因之后但其功能尚未完全清楚的。

SpvB氨基端与属于Lys/metR家族的乙酸钙不动杆菌的CatM抑制子、发光线虫TcaC（一种多组分的杀虫毒素）N端和昆虫沙雷菌的sepB均有同源性。1.2、spv结构基因的调控①首先，spv基因的表达和调控与细菌的生长阶段有关。SpvA的表达始于对数生长晚期，培养基中的营养物质如葡萄糖、氮、磷的减少可能是spv基因表达重要的刺激因素。另外，铁离子耗竭、培养环境、温度升高及酸性压力也可以在特定条件下诱导spv蛋白的表达。②第二个因素是spvR蛋白。Spv基因在稳定期由spvR蛋白调控表达，同时RpoS也参与调控，两者均起正性调控作用。由Lys-metR家族转录活化因子调节。③spv基因的表达还可能受细胞吞噬作用的调控：当细菌被吞噬后，spv基因被诱导后快速表达，其水平可以与稳定期基因表达水平相当。④培养环境中电解质的改变与营养的缺乏可能是刺激基因表达的主要机制。⑤

PhoP-PhoQ双因子调控系统是沙门氏菌基因在巨噬细胞内表达的一种重要的调节因素。⑥此外，还有很多因素也可影响spv的表达，如VacB/C调节系统和选择性sigma因子KatF等其他常见调节系统。3、spv的功能ⅰ增加沙门氏菌在肠外组织细胞内的生长，并与细菌血清抗性、黏附与定居有关。ⅱspv基因为细菌在巨噬细胞内存活和生长所必需，spv的毒力表现为细胞毒性，细菌增殖可致巨噬细胞分化和凋亡。沙门氏菌毒力岛沙门氏菌染色体、质粒或噬菌体上成簇分布的编码毒力相关基因的特定区域称为毒力岛（Salmonellapathogenicityisland，SPI）。目前已在沙门氏菌中发现5个毒力岛即SPI1-SPI5。

SPI-163’40kb,在部分血清型的沙门氏菌中的毒力岛的临界部分发现有IS3,介导沙门氏菌对上皮细胞的侵袭力,编码Ⅲ型分泌系统SPI-2tRNAval编码一个Ⅲ型分泌系统SPI-382‘selC与巨噬细胞内存活和在镁离子不足的条件下存活有关SPI-492‘在ssb和soxSR之间25kb，编码18个开放阅读框架。与type1分泌系统和巨噬细胞内存活有关SPI-5serT编码pipA,pipB,pipC,pipD等基因，不具有与全身感染有关的基因当鼠伤寒沙门氏菌的SPI-1毒力岛发生了突变，经口感染，对小鼠的毒力可降低15～50倍。但是如果经过腹腔途径感染，则毒力没有明显降低。这说明，SPI-1毒力岛主要与肠道粘附和侵袭有关。经过腹腔途径感染，使鼠伤寒沙门氏菌逃避了肠道屏障，SPI-1毒力岛的作用就表现不出来。而SPI-2毒力岛则不同。如果SPI-2毒力岛发生了突变，即使经过腹腔途径感染，伤寒沙门氏菌对小鼠的毒力也降低了10,000倍，就不能够引起全身性感染。尽管有一部分毒力基因位于毒力质粒上，但大多数毒力基因由染色体上的毒力岛编码。

通过特征标签突变（STM）证明与沙门氏菌侵袭力有关的许多基因集中在染色体63，和62.5，位点之间形成一个基因簇岛，即毒力岛SPI1；与细菌系统致病性有关的毒力基因在沙门氏菌染色体30，和31，位点之间形成一个基因簇岛，即毒力岛SPI2。2毒力岛的作用即SPI1～SPI5，大部分位于染色体上，小部分在质粒中;SPI1编码与侵袭力相关的Ⅲ型分泌系统（typeⅢsecretionsystem，TTSS）;SPI2编码与系统感染有关的Ⅲ型分泌系统。细菌Ⅲ型分泌系统是由多组分蛋白复合体形成的跨膜通道，它通过分泌毒力蛋白或将这些蛋白注入宿主细胞而发挥致病作用。SPI1与SPI2以外的毒力基因在致病中不起主要作用，但可能与沙门氏菌的宿主特异性和引起不同形式的疾病相关。2.1SPI1的分子结构SPI1全长约40kb，G+C含量为42%，位于沙门氏菌染色体的上游和下游分别为fhlA和mutS的63，位点处。它至少含29个编码TTSS各组分的基因，包括调节子和效应子。目前，在SPI1中已鉴定出39个基因，但并非所有的基因为TTSS所必须。其中，位于SPI1边缘的4个基因（sitA、B、C、E）与沙门氏菌的侵袭力无关，这个基因族编码一个铁摄入系统。SPI1与志贺氏菌毒力质粒上的spa/mxi/ipa基因结构非常相似。Fig5SalmonellaPathogenicityIslandI(SPI-1).GenemapofSalmonellainvasiongenelocatedatcentisome63.Arrowsindicatedirectionoftranscription.Genesencodestructuralcomponentsofthesecretionmachinery,effectorproteins,chaperoneproteins,andregulatorsasdescribedinthetext.SPI1编码的蛋白质具有以下功能：入侵宿主非吞噬细胞；（invA、B-粘附和/或侵袭）离体诱导巨噬细胞凋亡；（sifA整合宿主染色体）

SipA和SptP蛋白介导尚不清楚的功能。两个SPI都含有一组相似的编码TTSS的基因。

2.2SPI2的分子结构SPI2全长约40kb，含40多个基因，包括一个二元调节系统和一个TTSS。SPI2分为两部分，第一部分从tRNAvalV到ORF242，全长约25kb；这个区域内包含编码二元系统的基因（ssrA和ssrB）、编码TTSS结构成分的基因（ssa）、编码底物蛋白的基因（sse）和编码它们的特异性伴侣蛋白的基因（ssc）共4种基因，其中ssrA和ssrB是反向转录，而后3种基因是正向转录。第二部分位于ssrB和SPI2边缘之间，全长约15kb；这个区域内含5个ttr基因，包括编码连四硫酸盐还原酶基因（ttrA、B、C）和二元调节系统基因（ttrR、S）通过特征标签突变。SPI1和SPI2编码的TTSS的功能SPI1和SPI2的功能是通过TTSS分泌的底物蛋白实现的。底物蛋白按功能可分为3类：第一类为转运效应分子进入真核靶细胞的蛋白；第二类为效应分子蛋白#第三类为具有调节作用的蛋白。

FIG.6.

SPI2.ThepositionsandorientationsofinsertionsofmTn5insertions(openarrows)andtheaphTgenecassette(solidarrow)inmutantstrainsusedinthisstudyareshown.ThetranscriptionalorientationofSPI2genesencodingthetypeIIIsecretionsystemapparatus(ssa)andtheponentregulatorysystem(ssr)isindicatedbyarrows.cs,centisomes.

（1）粘附因子:也称定殖因子或粘附素，是沙门氏菌的纤毛成分，能与肠上皮细胞表面的甘露糖结合，这是沙门氏菌与肠上皮细胞接触并进入细胞内的一种方式。

与沙门氏菌毒力相关的表达产物（2）侵袭蛋白:

沙门氏菌侵袭宿主细胞时，先由TTSS分泌的SspC插入胞浆膜，再由SipC和SipA与细胞骨架的肌动蛋白结合，使骨架重排，有利于细菌进入;沙门氏菌hoP/phoQ系统尚能编码耐受阳离子抗菌肽及酸性环境的蛋白，调节酸性磷酸酶合成，使细胞内pH适合细菌生长。（3）肠毒素:

沙门氏菌肠毒素（S-LT）与霍乱毒素(CT）、大肠杆菌不耐热肠毒素（E-LT）有相似的生物学活性和致病机制，与神经节苷酯结合后便促进前列腺素E2（PGE2）合成，激活腺苷环化酶，使cAMP生成增多，后者刺激小肠上皮细胞分泌Cl-而抑制Na+吸收，从而造成分泌性腹泻。

(4)细菌防御机制:

沙门氏菌被巨噬细胞和中性粒细胞吞食后可通过过氧化氢酶和DNA修补系统来减轻和修补活性氧造成的DNA损伤;

鼠伤寒沙门氏菌katE/katG基因是编码Ⅰ型或Ⅱ型过氧化氢酶（HPⅠ或HPⅡ）的活性部位，故katE/katG基因突变株对H2O2较为敏感;若katF调节基因表达障碍，则其毒力大减。(5）诱导巨噬细胞凋亡:

侵袭性沙门氏菌侵入巨噬细胞后可通过Sips激活半胱氨酸一天冬酶-1（caspaes-1）引起迟发性细胞毒性，此过程依赖SPI2-TTSS和SpvB的ADP核糖基化活性;各型沙门氏菌所引起的疾病类型可能与其在巨噬细胞中存活时间以及其引起巨噬细胞损伤情况有关，其存活愈长，巨噬细胞损伤愈重，愈容易引起扩散。非侵袭性沙门氏菌一般不诱导巨噬细胞凋亡。沙门氏菌抗生素耐药性的产生机制有多种：第一，原有劣势耐药菌株／菌种过度生长；第二，在抗生素选择压力下，ＤＮＡ发生突变，使细菌具有耐药性；第三，细菌之间发生耐药基因的横向基因转移；

1、整合子（可传播60多种耐药基因。）

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