HPLC技术讲座系列之色谱柱的日常维护及应用解决方案课件

WelchMaterials,Inc.HPLC技术系列讲座之----

色谱柱的日常维护及

应用解决方案

主讲人：陈再洁（技术部工程师）月旭材料科技(上海)有限公司色谱柱的维护色谱柱使用的六大误区异常色谱峰产生的原因和解决方案一四三二色谱柱的正确使用概述一、色谱柱的正确使用正确的温度范围正确的PH范围正确的维护正确的流动相组成正确的保存良好的使用习惯仔细阅读说明书样品前处理正确安装色谱柱正确的温度范围正确的PH范围正确的维护正确的流动相组成正确的保存良好的使用习惯仔细阅读说明书样品前处理正确安装色谱柱正确的温度范围正确的PH范围正确的维护正确的流动相组成正确的保存良好的使用习惯使用前的准备工作样品前处理阅读使用说明书1）使用注意事项2）pH使用范围3）保存流动相按箭头方向连接色谱柱用流动相走基线至平稳进样使用前的准备工作按说明书要求活化色谱柱使用缓冲盐时需要特别注意置换，不要使缓冲盐析出特殊样品检测，需用样品溶液进行色谱柱老化色谱柱的正确连接如果伸出的管线长度过长，可能漏液

螺母坡度不匹配，密封性差

死体积区如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积HPLC的色谱柱接头HPLC常用色谱柱接头：厂家WelchWatersshimadzuPhenomenexAgilentdikma管前端长度/mm2.03.32.42.02.332.350

mL

柱外体积（管线）4321Time(min)0.00.51.01.52.010mL

柱外体积Time(min)0.00.51.01.52.04321样品:

1.苯丙胺酸2.5-苯基-3,6-二氧-2-哌嗪乙酸3.Asp-Phe4.天冬甜素4321Time(min)0.00.51.01.52.010mL

柱外体积Time(min)0.00.51.01.52.04321<0.12mm内径管线用于毛细管HPLC中<2.1mm内径色谱柱0.17mm内径管线用于分析型HPLC中2.1~4.6mm内径色谱柱0.25mm内径管线用于半制备型HPLC中9.4mm内径色谱柱0.5mm内径管线用于制备型HPLC中21.2mm内径色谱柱正确的PH使用范围

1、禁止在色谱柱PH值要求范围以外使用2、避免在色谱柱临界PH值处长期使用在什么样的PH值范围内使用色谱柱是正确的？保留时间酸性组份中性组份碱性组份方法稳定区方法波动区(pKa+1.5)

方法稳定区 液相柱---保留值与pH的关系不同填料基质对PH不同的耐受表现

有机无机杂化硅胶基质

(pH1.0-12.5）硅胶基质（pH2-7.5）Al2O3·nH2O(pH1-14）聚合物基质

(pH1-14）高柱效高机械强度

宽PH高或低pH下,硅胶会溶解化学修饰困难柱效不够高Welch公司反相色谱柱使用范围；Ultimate®是1.5-10.0CN填料是1.5-9.0Xtimate®是1.0-12.5Welchrom®是1.5-10.0LP系列填料是1.0-8.0常见缓冲盐的PH值

缓冲液 pKa pH范围磷酸盐pK1 2.1 1.1~3.1柠檬酸盐pK1 3.1 2.1~4.1甲酸盐 3.8 2.8~4.8柠檬酸盐pK2 4.7 3.7~5.7乙酸盐 4.8 3.8~5.8柠檬酸盐pK3 5.4 4.4~6.4磷酸盐pK2 7.2 6.2~8.2羟甲基甲胺 8.3 7.3~9.3氨 9.2 8.2~10.2硼酸盐 9.2 8.2~10.2甘氨酸 9.8 8.8~10.81-甲基-哌啶 10.3 9.3~11.3四氢化吡咯 10.5 9.5~11.5二乙胺 10.5 9.5~11.5三乙胺 10.7 9.7~11.7磷酸盐pK3 12.3 11.3~13.3正确的温度范围问：为什么色谱柱有温度要求？答：1、得到良好的时间重复性；

2、适当的提高柱温，可以减小流动相的粘度，降低色谱柱背压；升高柱效；

3、柱温过高，会加快填料的溶解，缩短色谱柱使用寿命.问:色谱柱的正确使用温度是多少？答：＜40℃（正常寿命）

；＞40℃（缩短寿命）

。正确的流动相的组成良好的化学性能各相之间良好的互溶性合适的缓冲盐浓度适宜的PH值范围适宜的有机相比例相塌陷甲醇水下的碳链形状100%水下的碳链形状

水乙腈

0.1%的醋酸柱子加压270bar持续10分钟水/乙腈(40/60)1ml/min30min0.1%的醋酸普通C8柱

0.1%的醋酸阿莫西林的检测：正确的保存色谱柱内不含缓冲盐或离子对试剂长期保存80%左右有机相保存（甲醇或乙腈）（短期保存，可以用不含缓冲盐的流动相保存）塑料堵头拧紧典型的有机物分析流程图采集样品处理仪器分析收集提取储存浓缩分离定性定量样品前处理的重要性提高检测限保护仪器色谱柱提高选择性样品前处理的一般原则：a、尽可能的除去样品杂质；b、使用流动相溶解样品；c、使用预处理柱（如：SPE小柱）除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质；d、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。二、色谱柱的维护色谱柱的维护特殊维护日常维护日常维护——每次分析完成后的色谱柱维护正向使用反向冲洗特殊维护——色谱柱出现异常时的维护柱压升高柱效降低固体颗粒物质堵塞缓冲盐析出填料污染固定相的流失强保留物质的累积正常升高异常升高什么是柱压正常升高？缓慢升高柱压在短时间内快速上升什么是柱压的异常升高？固体颗粒物质堵塞筛板流动相和样品中的固体颗粒物质流动相抽滤过0.45um滤膜样品针筒过滤0.45um滤膜泵密封圈和管路磨损产生的固体颗粒物质接保护柱接在线过滤器保护柱和在线过滤器缓冲盐的析出缓冲盐析是怎么析出的？怎样防止缓冲盐析出？有机溶剂/饱和缓冲液＝70/30ABC100%有机溶剂A+B＝C盐析出缓冲盐析出原理缓冲盐的正确使用方法流动相走基线过渡流动相过渡进样分析完成后用过渡流动相反向冲洗40min用甲醇或乙腈水溶液反向冲洗40min过渡流动相：指有机相和水相比例与分析流动相相同，或者水的比例”大于“分析流动相中缓冲盐溶液的比例

使用举例甲醇/缓冲液＝70/30—走基线进样√×甲醇/水＝70/30—过渡甲醇/缓冲液＝70/30—走基线进样甲醇/水＝70/30—过渡分析完成后用甲醇或乙腈冲洗色谱柱固定相的流失硅胶基质溶解规律——高水、高温度、高pH键合相流失规律——低pH、高水流动相pH、水相需限定在色谱柱允许范围内强保留物质累积的维护方案一.流动相中不含缓冲盐分析完成后，用纯甲醇或乙腈冲洗色谱柱45min；二.流动相中含有缓冲盐分析完成后，先用过渡流动相冲洗45min，然后再用纯甲醇或乙腈冲洗色谱柱45min；强保留物质累积的维护方案

Welch公司色谱柱最佳维护方案一.流动相中不含缓冲盐分析完成后，用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向冲洗色谱柱45min；二.流动相中含有缓冲盐分析完成后，先用甲醇（或乙腈）：水＝10：90反向冲洗45min，然后再用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向冲洗色谱柱45min；色谱柱再生

（用下列每种溶剂20~30倍柱体积冲洗）反相色谱柱100％甲醇---100％乙腈---75％乙腈/25％异丙醇---100％异丙醇---100％二氯甲烷---100％正己烷---100％异丙醇正相色谱柱50：50正己烷/氯仿---

甲醇---

二氯甲烷或者100%醋酸乙酯油脂类物质，可用异丙醇清洗处理正相色谱柱试剂严格除水色谱柱柱体积

4.6x50 0.83mL0.62 4.6x30 0.5mL0.37 4.6x250 4.15mL3.11 4.6x150 2.5mL1.87 2.1x50 0.17mL0.13 2.1x30 0.10mL0.08

色谱柱空柱管柱 尺寸 体积体积

(mm)（mL）（ml）三、异常色谱峰产生的原因和解决方案常见异常色谱峰：前延峰；拖尾峰；叉峰（裂峰）；宽峰/馒头峰。前延峰解决方案几种常见的前延峰峰前延解决方案1.样品过载前拖、后拖或平头峰2.溶剂效应----使用流动相溶解样品a.用纯甲醇溶解样品Tf＝0.891b.用流动相溶解样品Tf＝1.072流动相为乙腈：4%冰醋酸水溶液＝48：52

姜黄素标准品

用流动相溶解样品的替代方案用流动相稀释至原来浓度的1/4倍a.用纯甲醇溶解样品Tf＝0.811b.将a图中的样品用流动相稀释至原来浓度的1/4倍Tf=0.980c.用流动相溶解样品Tf＝1.028石杉碱甲标准品的测定

色谱柱：UlitmateXB－C18，4.6×250mm；

流动相：甲醇：缓冲盐溶液(0.08M醋酸铵水溶液，冰醋酸调节PH至6.0)＝25：75；

检测波长：308nm；

温度：室温26度；

流速:1ml/min；

进样量：20ul

3.缓冲盐浓度较低----增加流动相中缓冲盐的浓度a.乙腈：3%磷酸：无水乙醇＝80：10：10Tf＝0.737b.（乙腈：3%磷酸：无水乙醇）＝80：10：10）：50mM磷酸二氢钠＝80：20Tf＝0.930注射用苦参碱的测定

色谱柱：UltimateXB-NH2-2,5um,4.6×250mm；

柱

温：室温24度；

流速：1.0ml/min；

检测波长：220nm；

进样量：20ul；

4.流动相中加入适量的四氢呋喃a.50mM磷酸二氢钾（用2mol/L的KOH溶解调节pH5.0）/乙腈＝97.5/2.5Tf＝0.873c.50mM磷酸二氢钾（用2mol/L的KOH溶解调节pH5.0）/乙腈/THF＝97.5/2.5/1Tf＝0.986阿莫西林胶囊的测定

色谱柱：UltimateAQ－C18，5um，4.6×250mm；

检测波长：254nm；

温度：室温28度；

流

速：1.0ml/min；

进样量：20ul；

5）柱温太低----适当升高柱温的温度有助于增加流动相传质速率，减少因静电作用引起的前拖。

2）柱外死体积大色谱柱反冲，修复色谱柱；选择性能良好的色谱柱。

硬件原因：1）色谱柱损坏(筛板阻塞和柱头塌陷

)

、装填不当用细径管路和小体积流通池，各接口连接紧密。

拖尾峰解决方案

几种常见的拖尾峰地红霉素：Tf=1.268二甲基苯氧乙酸：Tf=1.991头孢地嗪钠：Tf=3.109拖尾峰解决方案通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形，而带有－COOH、－NH2、－NHR、－NR2等极性基团的化合物则比较容易产生拖尾拖尾产生机理——与分子结构有关这些基团的离子态－COO－、－N＋H3、－N＋H2R、－N＋HR2拖尾峰解决方案拖尾产生机理——与残余硅羟基有关硅羟基的特性：1）具有一定的极性－Si－Oδ－Hδ＋2）Si－OH的pKa为4.5~4.73）硅羟基的离子态－Si－O－拖尾峰解决方案头孢尼西钠的测定50mg/100ml

用流动相溶解样品Tf＝2.248

头孢尼西钠的测定0.5mg/100ml用流动相溶解样品Tf＝1.068头孢尼西钠的测定

色谱柱：Ultimate®XB－C18，5um，4.6×250mm波长：272nm流动相：0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节PH3.5）：乙腈＝84：16

温度：室温17℃流速：1.0ml/min进样量：20ul样品过载对峰形的影响色谱柱：Ultimate®XB－C18，5um，4.6×250mm

波长：280nm磷酸盐缓冲溶液的配制：准确称取磷酸二氢钠7.8g溶于1000ml水中，搅拌均匀，使之溶解，用磷酸将pH值调至2.50温度：室温26℃流速：1.0ml/min进样量：20ul流动相：甲醇：磷酸盐缓冲溶液=70：30（混合好后，测得pH为4.07）N＝15633Tf＝1.15流动相：甲醇：磷酸盐缓冲溶液=70：30（甲醇和磷酸盐缓冲溶液混合好后用磷酸调节pH至2.49）N＝16719Tf＝1.105二甲基苯氧乙酸结构式流动相中加入酸峰形后拖解决方案3.增加缓冲盐或增大缓冲盐的浓度溴化氢高乌甲素结构式色谱柱：Ultmate®XB-C18,5um,4.6×250mm波长：252nm流动相：甲醇：水＝75：25温度：室温15℃流速：1.0ml/min进样量：20ul用流动相溶解样品N＝1281Tf＝1.444色谱柱：Ultmate®XB-C18,5um,4.6×250mm波长：252nm流动相：甲醇：50mmol/L磷酸二氢钠溶液＝75：25（混合好后，用三乙胺调节pH至8.40，即200ml混合好的溶液中加入75ul三乙胺）温度：室温15℃流速：1.0ml/min进样量：20ul用流动相溶解样品N＝9230Tf＝0.987头孢噻肟钠结构式色谱柱：Ultimate®XB-C18,5um,4.6×250mm波长：254nm流动相：磷酸盐缓冲溶液：甲醇＝80：20（混合好后，测得pH为8.4）缓冲盐的配制：准确称取60mg磷酸二氢钾和磷酸氢二钠1.2g溶于1000ml水中，搅拌均匀柱温：室温12℃流速：1.0ml/min进样量：20ulN＝3422Tf＝2.503色谱柱：Ultimate®XB-C18,5um,4.6×250mm波长：254nm流动相：磷酸盐缓冲溶液：甲醇：三乙胺＝80：20：2（混合好后，用磷酸调节至pH8.4）缓冲盐的配制：准确称取60mg磷酸二氢钾和磷酸氢二钠1.2g溶于1000ml水中，搅拌均匀柱温：室温12℃流速：1.0ml/min进样量：20ul流动相中加入三乙胺2）柱外死体积大色谱柱反冲，修复色谱柱，选择性能良好的色谱柱。

硬件原因：1）色谱柱损坏(筛板阻塞和柱头塌陷

)，装填不当用细径管路和小体积流通池，各接口连接紧密。

3）色谱柱被强保留物质污染充分冲洗色谱柱。

峰分叉（裂峰）反向冲洗进样次数少进样次数多柱污染保护柱或分析柱被固体颗粒阻塞a、取下保护柱再进行分析；b、更换保护柱；c、柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施；d、反向冲洗色谱柱。峰分叉（裂峰）最有可能的原因修补色谱柱柱头塌陷峰分叉（裂峰）进样溶剂化效应峰分叉（裂峰）样品溶剂极性小于流动相样品溶剂尽可能与流动相匹配用流动相溶解样品其他原因及解决方案保护柱填料与分析柱填料不一致----更换保护柱，最好使用相同厂家相同品牌的保护柱和分析柱流动相碱性过强----由于硅胶溶解使柱塌陷峰分叉（裂峰）宽峰/馒头峰物质在色谱柱扩展宽峰/馒头峰流动相柱外效应色谱柱比例改变流速太低缓冲盐浓度低样品池过大记录仪响应时间太长色谱柱与检测器间管路不适合色谱柱或保护柱污染柱头塌陷色谱柱过载柱温过低比例改变流速太低缓冲盐浓度低比例改变流速太低流动相缓冲盐浓度低比例改变流速太低柱外效应样品池过大色谱柱与检测器间管路不适合柱外效应样品池过大记录仪响应时间太长色谱柱与检测器间管路不适合柱外效应样品池过大色谱柱色谱柱或保护柱污染柱头塌陷色谱柱色谱柱或保护柱污染色谱柱过载柱头塌陷色谱柱色谱柱或保护柱污染柱温过低色谱柱过载柱头塌陷色谱柱色谱柱或保护柱污染色谱柱使用过程中的不良习惯高流速再生色谱柱纯水才能冲干净缓冲盐使用缓冲盐时，不过渡色谱柱污染后，不对仪器进行清洗用极性相差太大的流动相互换使用过程中突然增加或减小柱压样品或流动相看不见杂质就不过滤塑料瓶装水或有机溶剂纯水或缓冲盐使用多天流动相混匀过滤、脱气后，又摇晃四、色谱柱使用六大误区色谱柱使用六大误区：1、HPLC色谱柱不能反转使用：反转后会出现填料塌陷、键合相无法展开

错误!装填色谱柱压力，