DNA测序教学讲解课件

第十三章

DNA芯片技术

DNAchips第一节

概述一、生物芯片的概念：生物芯片是指通过微电子、微加工技术在平方厘米大小的固体介质表面构建的微型分析系统，以实现对组织细胞中DNA、蛋白质和其他生物成分的快速、高效、敏感的处理与分析。二、生物芯片的类型：生物芯片DNA芯片蛋白质芯片组织芯片细胞芯片其它芯片样品制备芯片核酸扩增芯片毛细管电泳芯片微缩芯片实验室三、DNA芯片的类型：（一）按芯片制备方法分类：DNA芯片原位合成芯片（syntheticgenechip）

DNA微阵列芯片（DNAmicroarray）（二）按探针分类：DNA芯片寡核苷酸阵列（芯片）DNA阵列基因芯片cDNA芯片RNA芯片原位合成芯片与DNA微阵列芯片的比较原位合成芯片DNA微阵列芯片制作方法原位化学合成收集探针、显微打印探针类型寡核苷酸cDNA、基因片段、寡核苷酸、RNA等探针长度短，小于50nt较长，100~500nt

或更长

最高集成度10~401~10

万点阵/cm2

万点阵/cm2专利保护专利控制严格无专利控制第二节

DNA芯片的基本原理与方法DNA芯片技术流程图芯片制作样品的制备显微光蚀刻压电打印分子打印原位合成芯片探针设计与制备支持物预处理探针打印探针固化DNA微集阵列样品核酸的提取与纯化扩增与标记标记样品的纯化杂交及杂交后清洗扫描与分析一、芯片的制备（一）生物芯片支持物的预处理1、实性材料支持物的预处理硅片、玻璃片、瓷片、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯微珠、磁性微珠等。预处理：表面衍生出羟基、氨基等活性基团。这些基团在合成前用光敏保护基保护起来。氨基硅烷化或包被多聚赖氨酸。2、膜性材料支持物聚丙烯膜、尼龙膜、硝基纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜（PVDF）等。预处理：包被氨基硅烷或多聚赖氨酸。

带负电荷表面+++++++++++++++++++固定于玻璃片上的多聚赖氨酸-OH-OH-OH+-O-O-OSi-(CH2)3-NH2C2H3OC2H3OC2H3OSi-(CH2)3-NH2-O-O-OSi-(CH2)3-NH-C-NH-S-NH-C-HS-NH-C-HS1,4-苯二异硫氢酸氨丙基三乙氧基硅烷玻璃片H-C-NH-S-O-O-OSi-(CH2)3-NH-C-NH-S-NH-C-SNH-5`-DNANH-5`-DNAOSi-(CH2)3-SHSi-(CH2)3-SHOOOSi-(CH2)3-S-S-(CH2)6-O-(PO3)-(T)10-OligomerOOSi-(CH2)3-S-S-(CH2)6-O-(PO3)-(T)10-Oligomer玻璃片N2或真空（二）原位合成芯片的制作1、显微光蚀刻技术T-XXOXOXOXTXTXOXCXTXTCATXCCATTCCTCCTGGC-XXOXOXOXTXTXOXOXOHOHOXOXOXOXOXO第一轮第二轮第三轮TCGATCGTCTTTTTCCCGGATTCTCGTCGATCGATCGATTTT2、压电打印法（三）DNA微集阵列芯片的制作1、探针的制备（1）已克隆的基因片段；（2）PCR、RT-PCR等方法扩增的基因片段；（3）人工合成的DNA片段（寡核苷酸）；（4）细胞中分离的RNA；（5）人工合成的肽核酸。OHNOHNNNOBOOHNOBNOOBBOOBOOBOPO-OOPO-OOPO-ODNAPNA2、探针的打印

1、喷墨打印

2、针式打印3、探针的固化二、样品的制备1、核酸样品的分离纯化2、靶DNA的扩增（PCR）3、样品核酸的标记常用标记：荧光标记物、生物素、放射性同位素。4、标记后样品的纯化三、分子杂交杂交信号的强弱与样品中靶基因的量呈正比。杂交过程中的位阻作用。杂交的条件：盐的浓度杂交的温度杂交时间探针的G+C含量探针所带电荷靶序列的二级结构四、检测分析方法：

激光扫描仪；激光共聚焦扫描仪。检测器反光镜激光束荧光束光束分离器物镜支持物向四周发射的荧光发射光滤光镜检测透镜共聚焦针孔共聚焦扫描示意图第三节DNA芯片技术的应用

DNA芯片技术的应用DNA序列测定基因表达分析基因诊断药物研究与开发其它

DNA序列测定DNAsequencing第一节概述一、DNA序列测定即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。

1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和MaxamGilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和MaxamGilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。二、DNA序列测定工作原理

在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链DNA片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差1个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影，可直接读出DNA的序列。三、核酸序列分析的目的意义和策略（具体方法）（一）序列分析的目的，2种：1、确证性测序通过测定对突变进行定位和鉴定，应用时测定野生型基因上同源区和突变体的相应序列直接在一张胶片上比较二者序列差异。（已知基因序列）2、从头序列目的是提供一段DNA准确的核苷酸序列。（未知基因序列）（二）测定在生物医学领域相应应用，2个方面：1、对已知基因序列检查，特别是有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变，有助于阐明疾病发病机理及建立相应诊疗方案。2、对已经克隆的未知序列进行测定，从而阐明该基因的一级结构，如人类基因组计划中大量的工作是要阐明克隆片段的核苷酸的排列顺序。四、测序的常用方法1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速8-10h。

不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下：1、制备待测DNA序列模板；2、酶促或化学反应将其转变“等差数列”（n=1）；3、PAGE；4、读序。五、测序的基本过程一、Sanger双脱氧链终止法原理双脱氧终止法是由Sanger于1977年建立的DNA序列测定方法，也称为引物合成法或酶促合成法。

反应物：（1）待测DNA模板，可以是单链也可以是双链。（2）DNA聚合酶Ⅰ

常用Klenow片段催化特点：①模板为DNA；②原料为dNTP；③存在引物的3`-OH；④遵守碱基配对原则；⑤合成方向5`-3`；⑥校读作用。（3）原料——dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）。其中一种带32P或35S放射性标记。（4）脱氧核苷酸链延伸的特异性终止剂——2`，3`-双脱氧核苷三磷酸（2`，3`-dideoxynucleosidetripsphate,ddNTP）NHHPPPOOOOOOHOHOHHO2`-脱氧核苷三磷酸（dNTP）OOHHHHOCH2A、G、C或TNHHPP32POOOOOOHOHOHHO-32P-

dNTPOOHHHHOCH2A、G、C或TNHHPPPOO35SOOOHOHOHHO-35S-dNTPOOHHHHOCH2A、G、C或TNHHPPPOOOOOOHOHOHHO2`，3`-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）OHHHHOCH2A、G、C或T（5）引物——一段寡核苷酸片段

反应过程：（1）引物的结合引物（其5`-末端带有标记）与模板DNA3`端互补结合；GATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH引物结合部位3`5`5`3`（2）模板链互补链的合成在DNA聚合酶Ⅰ（或Klenow片段）的催化下，按碱基配对原则，逐个将dNTP加到引物的3`-OH端，合成模板链的互补链；3`5`GATCCCTGAGTAGTCACCTAGGGACTCATC-OH5`3`（3）脱氧核苷酸链延伸的终止在实验中设4组反应体系，每一体系中加入4种dNTP混合物和一种ddNTP。反应时，ddNTP和dNTP会竞争掺入新生DNA链中，使DNA链延伸终止，并以ddNTP结尾。由于ddNTP比例较低，所以终止位点是随机的。经过适当的温育之后，将会合成不同长度的DNA片段。

在含ddATP

的反应管中，DNA片段均以ddATP结尾。同理，含ddGTP

、

ddCTP或ddTTP的反应管中，DNA片段分别以ddGTP、ddCTP或ddTTP结尾。

CTAGGGACTAGGGACTCACTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddATPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`Klenow（4）合成产物的电泳分离将上述4个反应混合物平行加到同一变性聚丙烯酰胺凝胶的4个相邻的泳道上作电泳分离。分辨率可达1bp。（5）放射性自显影。（6）从胶片上，直接读出单链DNA的核苷酸顺序。反应物AGCT模板DNA++++引物++++4种dNTP++++ddNTP

ddATP

ddGTP

ddCTP

ddTTPKlenow++++Buffer++++反应过程及生成物：

设4组反应体系，组成如下：CTAGGGACTAGGGACTCACTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddATPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`A组KlenowAAACTAGGGA3`CTAGGGACTCA3`CTAGGGACTCATCACTAGGGACTCATCAGTGmarkerAA组的电泳结果CTAGGCTAGGGCTAGGGACTCATCAGCTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddGTPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`G组KlenowGGGCTAGG3`CTAGGG3`CTAGGGACTCATCAGCTAGGGACTCATCAGTGmarkerGG组的电泳结果GCTAGGGACCTAGGGACTCCTAGGGACTCATCCTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddCTPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`C组KlenowCCCCTAGGGAC3`CTAGGGACTC3`CTAGGGACTCATCCTAGGGACTCATCAGTGmarkerCC组的电泳结果CTAGGGACTCTAGGGACTCATCTAGGGACTCATCAGTCTAGGGACTCATCAGTG5`3`3`3`3`5`5`5`dATP、dGTPdCTP、dTTPddTTPGATCCCTGAGTAGTCACCTAG-OH3`5`5`3`T组KlenowTTTCTAGGGACT3`CTAGGGACTCAT3`CTAGGGACTCATCAGTCTAGGGACTCATCAGTGmarkerTT组的电泳结果TTTCCCGGGGAAA45678910111214151617markerTAGC电泳方向GATCCCTGAGTAGTCAC3`5`5`3`CTAGGGACTCATCAGTG二、DNA序列测定的策略（一）末端终止法常用试剂1、载体（1）M13噬菌体载体。用于单链模板的克隆和测序（2）pUC质粒载体。用于双链模板的克隆和测序。2、通用引物（一般含15~30bp）通用引物

载体DNA互补序列

待测DNA合成新链

载体DNA互补序列

通用引物

合成新链

4、放射性标记目前常用的是[35S]-dATP5、DNA聚合酶（1）Klenow片段