第二章蛋白质

第二章蛋白质化学

概述氨基酸与肽蛋白质的结构蛋白质的重要性质蛋白质的分离和纯化Protein第一节概述蛋白质的概念：

蛋白质是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子。其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。概述蛋白质的重要性：蛋白质是生物体内必不可少的重要成分蛋白质占干重人体中（中年人）人体45%水65%蛋白质19%

细菌50%~80%脂肪19%糖类＜1%

真菌14%~52%无机盐7%蛋白质是生物功能的主要体现者蛋白质的重要性有机体内的结构组分催化功能：酶调节功能：激素、受体运输功能：血红蛋白、载脂蛋白免疫功能：抗体运动功能：贮藏功能：遗传信息表达的调节生物膜的功能：信号传递蛋白质的化学组成元素组成：

一类含氮有机物，含有碳、氢、氧、氮和少量硫。某些蛋白质还含有磷、铁、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：

C（50-55%）O（20-30%）

H（6-7%）S（0-2.5%）

N（15-18%）含量稳定，可测定蛋白质的含量蛋白质含量=含氮量÷16%=含氮量×6.25蛋白质的构成单位：氨基酸，20种α-氨基酸第二节氨基酸氨基酸（AminoAcid，AA）的结构特点

pH7.0附近与羧基相邻的α碳上有一个氨基，为两性电解质，通常为兼性离子；除甘氨酸外，氨基酸的α碳都是不对称碳原子；天然存在的氨基酸主要是L-型，同时有旋光性。氨基酸的结构和分类氨基酸的主要性质CCOOHRHNH2CCOOHNH3+αRαH甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R脂肪族氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸酰胺类碱性氨基酸醇羟基氨基酸含硫氨基酸亚氨基酸吲哚基咪唑基支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸含羟基的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巯基）、甲硫氨酸（含硫甲基）含苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸含吲哚基的氨基酸：色氨酸含胍基的氨基酸：精氨酸含咪唑基的氨基酸：组氨酸亚氨基酸：脯氨酸含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺含ε-氨基的氨基酸：赖氨酸氨基酸的分类按R基团的酸碱性：酸性氨基酸：有2种，即天冬氨酸、谷氨酸、碱性氨基酸：有3种，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸中性氨基酸：15种，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸。氨基酸的分类按照R基团的极性分：非极性氨基酸：共7种。极性不带电荷的氨基酸：共8种极性带正电荷的氨基酸：3种极性带负电荷的氨基酸：2种非极性疏水性氨基酸2.极性不带电荷的氨基酸3.酸性氨基酸4.碱性氨基酸几种特殊氨基酸Gly：无手性碳原子。Pro：环状亚氨基酸。Cys：可形成二硫键。脯氨酸（亚氨基酸）半胱氨酸

+胱氨酸二硫键-HH修饰氨基酸：蛋白质合成后通过修饰加工生成的氨基酸。没有相应的编码。如：胱氨酸、羟脯氨酸（Hyp）、羟赖氨酸（Hyl）。非生蛋白氨基酸：蛋白质中不存在的氨基酸。如：瓜氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸，是代谢途径中产生的。

氨基酸的主要性质氨基酸的紫外吸收

芳香族AA—Tyr，Trp，Phe可以吸收280nm的紫外光，据此可对蛋白质进行定量和定性氨基酸的酸碱性质及等电点氨基酸的重要化学反应氨基酸侧链的反应含苯环氨基酸的紫外吸收氨基酸在可见光区没有光吸收，而酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在近紫外区(220-300nm)具吸收光。酪氨酸的max＝275nm苯丙氨酸的max＝259nm色氨酸的max＝280nm氨基酸的酸碱性质与等电点氨基酸在结晶形态或在水溶液中，以两性离子形式存在。氨基以质子化(-NH3+)形式存在，羧基以离解状态(-COO-)存在。在不同pH下，两性离子的状态也随之发生变化。

正离子两性离子负离子

pH＜pIpH＝pIpH＞pI

Henderson-Hasselbalch方程

[共轭碱]pH＝pK＋log————-

[共轭酸]

pH7.0时7.0=2.0+lg([RCOO-]/[RCOOH])([RCOO-]/[RCOOH]=100000:17.0=10.0+lg([RNH2]/[RNH3+])([RNH2]/[RNH3+]=1:1000等电点（isoelectricpoint,pI）：当氨基酸在溶液中净电荷为零的pH。在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在。当溶液的pH=pI时，氨基酸主要以两性离子形式存在。pH<pI时，氨基酸主要以正离子形式存在。pH>pI时，氨基酸主要以负离子形式存在。

氨基酸等电点的计算氨基酸等电点的计算多个pK值时，按靠近原则取平均值。不带电荷的AA：pI=（pK1+pK2

）/2带正电荷的AA：pI=（pK2+pKR

）/2带负电荷的AA：pI=（pK1+pKR

）/2氨基酸的重要化学反应氨基酸α-氨基与甲醛的反应氨基酸与茚三酮反应氨基酸α-氨基与2,4-二硝基氟苯的反应氨基酸α-氨基与异硫氰酸苯酯的反应氨基酸α-氨基与丹磺酰氯的反应与甲醛的反应AA具有酸碱性，但不能用正常的酸碱滴定进行测定。甲醛可以掩盖氨基，使AA成为普通酸，可用氢氧化钠滴定与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。与茚三酮的反应α-氨基和α-羧基共同参加的反应：茚三酮在弱酸性溶液中与α-氨基酸共热，氨基酸发生氧化、脱羧作用变成醛，茚三酮本身变成还原茚三酮，后者再与茚三酮和氨作用生成蓝紫色化合物，最大光吸收在570nm。该反应是检测和定量氨基酸和蛋白质的重要反应。脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应显黄色。与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应Sanger反应：弱碱溶液中氨基酸与DNFB反应生成黄色的二硝基苯氨基酸（DNP氨基酸）。应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸虽然多肽侧链上的ε-NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，容易与DNP氨基酸区分和分离。与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应Edman反应：弱碱性条件下，与氨基酸反应生成苯乙内酰硫脲（PTH-氨基酸）应用：用来鉴定多肽或蛋白质的N-末端AA，能够不断重复循环将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。是迄今在蛋白质或多肽顺序测定技术中，最有效和最基本的方法。

与丹磺酰氯（DNS-Cl）的反应

丹磺酰氯与氨基酸反应生成荧光物质DNS-氨基酸，是Edman降解法的改进方法。用DNS测定N端氨基酸，原理DNFB法相同，但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定。由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍，可用于微量氨基酸的定量。侧链反应（颜色反应）Millon反应：Tyr或含Tyr的蛋白质与汞的硝酸盐和亚硝酸盐溶液形成红色的化合物。Folin反应：Tyr或含Tyr的蛋白质与Folin试剂（磷钼酸、磷钨酸混合溶液）反应产生蓝色的钼蓝、钨蓝。坂口反应：Arg或含Arg的蛋白质与坂口试剂（α-萘酚的碱性次溴酸钠溶液）反应产生砖红色的沉淀。反应名称试剂颜色反应有关基团有此反应的蛋白质或氨基酸双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键所有蛋白质米伦反应HgNO3Hg(NO3)2及HNO3混合物红色

Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反应乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色

Trp坂口反应α-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基α-氨基酸侧链反应（颜色反应）Pauly反应：His及含His的蛋白质与Pauly试剂(对氨基苯磺酸盐酸溶液、亚硝酸钠、碳酸钠混合溶液)反应产生橘红色的化合物。乙醛酸的反应：Trp或含Trp蛋白质与乙醛酸和浓硫酸在试管中叠加时，产生分层现象，界面出现紫色环。巯基的反应：Cys或含Cys蛋白质与亚硝基亚铁氰酸钠在稀氨溶液中，产生一种红色的化合物。第三节肽肽(peptide)肽键(peptidebond)：由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。肽：由二个或两个以上氨基酸通过肽键相连而形成的化合物。肽链：氨基酸之间通过肽键连接形成的链。氨基酸残基：肽链中每个氨基酸单位失去1分子水。+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键多肽链

N端

氨基酸残基C端几种生物活性肽谷胱甘肽(GSH)结构:GSH过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH还原酶NADPH+H+NADP+脑啡肽：为五肽，具有镇痛作用。

Met-脑啡肽

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Leu-脑啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-抗菌肽：抑制细菌和其他微生物生长或繁殖的肽类。青霉素：含有D-半胱氨酸和D-缬氨酸的二肽衍生物。肽类激素：如促甲状腺素释放激素（TRH）第四节蛋白质的结构蛋白质的一级结构(primarystructure)蛋白质的空间结构二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)一级结构（AA序列）二级结构三级结构（球蛋白）四级结构（聚合体）一、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构：指多肽链中氨基酸的排列顺序与键合方式。主要的化学键：肽键，有些蛋白质还包括二硫键。一级结构是蛋白质空间构象和生物学功能的基础。胰岛素的一级结构二、蛋白质的二级结构二级结构：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主要化学键：氢键肽单元肽键的双键性质：键长介于C-N单键和双键之间，具有部分双键的性质，不能自由旋转。C-N0.149nm、C=N0.127nm、C-N肽键0.132nm肽单元：参与组成肽键的6个原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽键平面。它是蛋白质构象的基本结构单位。肽单元HHHH蛋白质二级结构的主要形式-螺旋(-helix)

：是蛋白质中最常见的一种二级结构

-折叠(-pleatedsheet)

-转角(-turn)

无规卷曲(randomcoil)

α-螺旋结构α-螺旋的特点：3.613多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋每圈螺旋含3.6个氨基酸，螺距0.54nm，每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm，旋转100°每个肽键的羰基氧和第四个肽键的亚氨氢形成氢键维持螺旋稳定。氢键与螺旋长轴基本平行。AA残基的R侧链分布在螺旋的外侧。影响α-螺旋形成和稳定的因素多肽链中出现pro，α-螺旋中断，产生一个弯曲或结节。Gly的R基太小，难以形成α-螺旋所需的两面角，破坏螺旋的稳定。多肽链中连续出现带同种电荷的极性氨基酸，α-螺旋不稳定。肽链中连续出现庞大侧链的氨基酸如Ile，由于空间位阻，也难以形成α-螺旋。β-折叠β-折叠：若干条肽链或一条肽链的若干肽段平行排列，相邻肽链之间靠氢键维持。β-折叠的特点：多肽链处于伸展状态，相邻肽单元间折叠成锯齿状，AA残基的R基团位于锯齿结构的上下方。相邻两个AA残基之间的距离为0.36nm。靠链间氢键维持结构稳定，氢键与链的长轴接近垂直。相邻肽链可平行排列，也可反向平行。β-折叠平行β折叠反平行β折叠α-螺旋与β-折叠比较α-螺旋β-折叠形状棒状片状多肽链状态紧紧盘绕几乎完全伸展氢键形式链内氢键链间氢键AA间距0·15nm0·36nmR基团位置螺旋外侧折叠上下角蛋白丝蛋白β-转角β-转角：多肽链内180°回折。结构：由四个氨基酸组成，第一个氨基酸的羰基与第四个氨基酸的氨基形成氢键。Gly和Pro出现机率高，第二个氨基酸残基常为Pro。作用：负责二级结构单元之间的连接。无规则卷曲：没有规律肽链结构各类氨基酸与蛋白质二级结构关系超二级结构超二级结构（supersecondarystruture）：蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。种类：

αα；ββ；βαβ；βββ．ααβββαβ钙结合蛋白中结合钙离子的基序

锌指结构结构域结构域（domain）：在超二级结构基础上组装成的相对独立的三维实体。折叠得较为紧密，各行使其功能。结构域的大小

变化很大，常见的范围在100-200个残基之间。结构域的特点：结构域之间常有裂隙，较松散，是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上．结构域之间由“铰链区”相连，分子构象有一定的柔性。结构域可作为结构单位进行相对独立的运动。三、蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构：在二级结构基础上，多肽链进一步折叠盘绕成特定的空间结构。即整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。作用力：非共价键（疏水相互作用）。特点:整个分子紧密结实亲水侧链分布于分子表面大部分疏水性基团埋于分子内部肌红蛋白(Mb)单肽蛋白质，含有153个氨基酸，有8个螺旋区。分子伴侣分子伴侣：一种可增加蛋白质正确折叠速率的蛋白质，通过与没有完全折叠好的新合成多肽链结合发挥协助折叠的作用。*分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合、松开，防止错误的聚集发生。*分子伴侣可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。*分子伴侣对蛋白质分子折叠过程中正确形成二硫键起重要作用。四、蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构：

二个或二个以上具有独立三级结构的多肽链，彼此借次级键相连，形成的空间结构。蛋白质的亚基（subunit）：每一条多肽链都有完整的三级结构。维持作用力：主要是疏水作用、氢键和离子键血红蛋白的结构蛋白质分子中的共价键与次级键一级结构→二级结构→三级结构→四级结构维持蛋白质构象的化学键

维系二级结构：氢键维系三级结构：疏水键、氢键、范德华力、离子键维系四级结构：疏水键、氢键、范德华力、离子键第五节蛋白质结构与功能的统一

一级结构与功能的关系蛋白质一级结构的种属差异与分子进化蛋白质的一级结构与分子病一级结构的局部断裂与蛋白质的激活蛋白质空间结构与功能的关系蛋白质的一级结构决定其空间结构别构效应：变构效应一级结构的种属差异与分子进化

不同种属来源的同种蛋白质存在种属差异，但与活性和蛋白质空间结构密切相关的氨基酸残基高度保守。一级结构与分子病例：镰刀形红细胞贫血N-Val·His·Leu·Thr·Pro·Glu·Glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-Val·His·Leu·Thr·Pro·Val·Glu·····C(146)

这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。一级结构的局部断裂与蛋白质的激活

某些蛋白质分子初合成时，常呈无活性状态的蛋白质原。蛋白质原部分肽链以特定方式断裂后，才变为活性分子。一级结构是空间构象的基础牛核糖核酸酶的一级结构二硫键肌红蛋白（Mb）与血红蛋白（Hb）的结构蛋白质空间结构与功能的关系Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。协同效应与变构效应协同效应：寡聚蛋白的一个亚基与其配体结合后，能影响其他亚基与配体结合能力的现象。正协同效应：促进作用负协同效应：抑制作用变构效应：蛋白质（或亚基）因与某小分子物质相互作用而发生构象变化，导致蛋白质（或亚基）功能的变化。第六节蛋白质性质蛋白质的两性解离和等电点蛋白质的胶体性质蛋白质的沉淀作用蛋白质的变性作用蛋白质的呈色作用蛋白质的两性解离与等电点蛋白质分子中可解离基团：肽链氨基端的氨基和羧基端的羧基碱性基团：Lysε-氨基，Arg胍基，His咪唑基酸性基团：Aspβ-羧基，Gluγ-羧基，Tyr酚羟基，Cys巯基蛋白质的两性解离与等电点等电点：当蛋白质所带的正、负电荷恰好相等，净电荷为零时溶液的pH值。每种蛋白质都有它特有的等电点

蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系蛋白质的胶体性质胶体形成的条件：质点大小在1~100nm之间质点带有相同电荷质点与溶剂分子相结合形成溶剂化层蛋白质形成胶体的条件：蛋白质分子直径约为2~20nm蛋白质具有解离基团，一定pH时带相同电荷蛋白质分子表面具有亲水基团，容易发生水化现象蛋白质的胶体性质蛋白质胶体稳定的因素：双电层和水化层胶体性质的应用：由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，可应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。或用超滤法分离蛋白质与小分子物质。透析半透膜蛋白质溶液水+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的沉淀蛋白质沉淀作用等电点沉淀：改变溶液pH值，中和蛋白质表面电荷，蛋白质双电层被破坏而沉淀。盐析：无机盐中和蛋白质表面电荷并破坏水化层，使蛋白质聚集沉淀。有机溶剂沉淀：由于有机溶剂亲水性比蛋白质分子大，抢夺蛋白质表面水化层使之聚集沉淀。金属离子沉淀：在碱性条件下与重金属盐结合而沉淀。生物碱沉淀：在酸性条件下与生物碱结合而沉淀。蛋白质变性作用蛋白质的变性：在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子特定空间构象被破坏，导致其理化性质改变和生物活性的丧失。变性的因素物理因素:热、紫外线、X-射线、超声波化学因素:酸碱、有机溶剂、变性剂、重金属

变性的实质：空间结构改变或破坏变性的机理：从紧密有序结构→松散无序的结构蛋白质变性作用变性后蛋白质性质发生改变生物活性丧失一些侧链基团暴露某些理化性质改变蛋白质溶解度降低结晶能力丧失粘度增加，扩散系数下降旋光性发生变化，等电点有所提高生物化学性质改变：容易被蛋白酶水解蛋白质的变性作用变性的类别：可逆性变性：除去变性因素后，已变性的蛋白质重新恢复到天然构象。主要涉及三级以上结构变化。不可逆变性：蛋白质的二级结构也遭到破坏。复性：若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能。

天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性蛋白质的呈色反应双缩脲反应：蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜反应，生成红色或紫色物质。含有两个及以上肽键的化合物均可发生双缩脲反应。茚三酮反应：蛋白质能与水合茚三酮反应呈蓝色。第七节蛋白质的研究技术蛋白质分离、纯化的一般步骤细胞破碎：