第二章 分子克隆工具酶

第二章分子克隆工具酶第一页，共七十四页，编辑于2023年，星期一

基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。分子克隆工具酶第二页，共七十四页，编辑于2023年，星期一工具酶

核酸内切酶核酸外切酶DNA连接酶DNA聚合酶DNA及RNA修饰酶单链核酸内切酶第三页，共七十四页，编辑于2023年，星期一酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切割DNA分子DNA连接酶连接两个DNA分子或片段大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶1制作DNA探针；2合成cDNA第二链；3填补双链DNA3`凹端；4DNA测序。TaqDNA聚合酶聚合酶链式反应（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端标记探针末端转移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解单链DNA或RNADNA酶Ⅰ在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解RNA逆转录酶补平反应，合成cDNA或制探针磷酸酶切除核酸末端磷酸基SUMMARY第四页，共七十四页，编辑于2023年，星期一1限制性内切酶1.1引言--核酸酶和限制性核酸内切酶的定义1.2限制性核酸内切酶的命名1.3限制性核酸内切酶的分类1.4限制性核酸内切酶活性及其影响因素第五页，共七十四页，编辑于2023年，星期一核酸酶（Nuclease）：通过切割相邻两个核苷酸残基之间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。1）按作用对象可分为:Deoxyribonuclease(DNAase)&Ribonuclease(RNAase)2）按水解断裂核酸分子不同方式可分为：Endonuclease&Exonuclease1.1引言--核酸酶和限制性核酸内切酶的定义第六页，共七十四页，编辑于2023年，星期一限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease):

指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。

限制酶天然存在于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统（Restriction-ModificationSystem)。第七页，共七十四页，编辑于2023年，星期一EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号

若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。1.2限制性核酸内切酶的命名第八页，共七十四页，编辑于2023年，星期一1.3限制性核酸内切酶的分类1.3.1Ⅰ型限制性内切酶1.3.2Ⅱ

型限制性内切酶1.3.3Ⅲ

型限制性内切酶第九页，共七十四页，编辑于2023年，星期一1.3.1Ⅰ型限制性内切酶功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点（随机性）；应用：不常用。第十页，共七十四页，编辑于2023年，星期一1.3.2Ⅲ型限制性内切酶功能：限制、修饰特点：需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在识别位点外，距识别位点3`端24-26bp处。应用：数量很少，分子克隆中无实际作用。第十一页，共七十四页，编辑于2023年，星期一1.3.3Ⅱ型限制性内切酶功能：识别并特异切割DNA分子。

即通常所指的DNA限制性核酸内切酶；反应特点：仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，能识别双链DNA的特殊序列，并可特异切割DNA，产生特异性的片段；应用：种类繁多，分子克隆中最常用的内切酶。第十二页，共七十四页，编辑于2023年，星期一限制性内切酶限制酶第十三页，共七十四页，编辑于2023年，星期一限制性内切酶分布：主要在微生物中。作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。举例：大肠杆菌的一种限制酶EcoRI能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做黏性末端。第十四页，共七十四页，编辑于2023年，星期一(1)基本特性识别长度为4-8个核苷酸的特异序列；最常见的为6个碱基.许多识别序列具回文结构，如HindⅢ的识别序列：

5`AAGCTT3`3`TTCGAA5切割产生的末端有粘端

(cohesive/stickyend)如BamHI(G↓GATCC)和平端

(bluntend)如SmaI(CCC↓GGG)第十五页，共七十四页，编辑于2023年，星期一PstⅠ切割后产生3ˊ粘性末端：有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端（Bluntend）,如SmaⅠ：第十六页，共七十四页，编辑于2023年，星期一EnzymeRecognitionsequenceEnzymeRecognitionseuqenceBamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAGRecognitionSequencesandCuttingsitesofselectedRestrictionEndonucleases第十七页，共七十四页，编辑于2023年，星期一(2)同裂酶（isoschizomer）

识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。①同序同切酶

这些酶识别序列和切割位置都相同

HindⅡ与HincⅡ识别切割位点为GTY↓RAC

，HpaⅡ与HapⅡ识别切割位点为C↓CGGMobⅠ与Sau3AⅠ识别切割位点为↓GATC

。第十八页，共七十四页，编辑于2023年，星期一②同序异切酶

KpnⅠ和Acc65Ⅰ识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同，分别为GGTAC↓C和G↓GTACC。

③“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如EcoRⅠ识别和切割位点为G↓AATTC，ApoⅠ

识别和切割位点为R↓AATTY，后者可识别前者的序列。

④其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在pUC系列质粒的多克隆位点中有一个SalⅠ位点（识别切割位点为G↓TCGAC），该位点也可被AccⅠ（识别切割位点为GT↓MKAC）和HincⅡ（识别切割位点为

GTY↓RAC）切割。第十九页，共七十四页，编辑于2023年，星期一(3)同尾酶有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶（isocaudamer)

如：

BamHI:G↓GATCC

BglII:A↓GATCBclⅠ:5’-T↓

GATCA-3第二十页，共七十四页，编辑于2023年，星期一1.4

限制性核酸内切酶活性

及其影响因素(1)

活性大小：酶对DNA水解程度不同。(2)酶的活性单位：在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。第二十一页，共七十四页，编辑于2023年，星期一(3)限制性核酸内切酶的反应条件1)底物DNADNA纯度:RNA与E结合影响有效酶浓度；

DNA浓度:

[DNA]过大，抑制酶活，影响酶分子扩散如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃15h1μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃1h

第二十二页，共七十四页，编辑于2023年，星期一

2)反应系统因素缓冲液（无菌、无污染）buffer（pH=8.0）：50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巯基乙醇100μgBSA/ml（DDT：二硫苏糖醇BSA：牛血清蛋白)

NaCL（0,500,1000mM）金属离子如：Ⅱ型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如HindⅢ，ECORI）则特异性改变。离子浓度不合适会抑制酶活。牛血清蛋白(BSA)BSA是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量BSA会引起电泳拖尾限制性核酸内切酶的反应条件第二十三页，共七十四页，编辑于2023年，星期一限制性核酸内切酶的反应体系Buffer（10x）3LDNA（质粒、载体、总DNA….0.1-1g酶2uddH2OBSA（1%）3L30L酶量不超过总体积的1/10第二十四页，共七十四页，编辑于2023年，星期一思考题用限制酶BglⅡ消化2ｕgλDNA，该DNA浓度为125ｕg/mL，BglⅡ为4units/ｕL.并提供了限制酶BglⅡ的10倍的缓冲盐体系。请设计一最佳方案来完成该实验第二十五页，共七十四页，编辑于2023年，星期一限制性内切酶的选择原则：选常见的、活性高的酶，如果双酶切最好选有公用Buffer的酶推荐酶：Promega公司，Takara公司，Tyoyobo公司第二十六页，共七十四页，编辑于2023年，星期一双酶切A有公用Buffer的。（直接用公用Buffer切）B两种酶反应温度不同的。（先切其中一个然后高温失活，再用另外一个酶切）C无公用Buffer的：先用低盐Buffer切几个小时，再补加盐分到高盐加入另外一个酶继续切第二十七页，共七十四页，编辑于2023年，星期一3.星活性在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性,如EcoRⅠ星活性用EcoRⅠ*表示。

影响因素：甘油浓度高（>5%），酶过量（>100U/ml），离子强度低（<25mM），pH值过高（>8.0），45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子，12%乙醇。限制性核酸内切酶的反应条件第二十八页，共七十四页，编辑于2023年，星期一DNA末段的长度对限制酶切割的影响需要在识别序列两端存在一定长度的非识别序列增加切割效率

第二十九页，共七十四页，编辑于2023年，星期一位点偏爱（Sitepreference）

某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。第三十页，共七十四页，编辑于2023年，星期一1.5

限制酶的用途

1.

在特异位点上切割DNA，产生特异的限制片断

2.

建立限制酶（物理）图谱绘制

3.

构建基因文库

4.用限制酶切出相同的粘性末端，以便重组第三十一页，共七十四页，编辑于2023年，星期一2DNA连接酶2.1定义及功能2.2种类及作用机理2.3使用时的注意事项第三十二页，共七十四页，编辑于2023年，星期一2.1定义及功能DNA连接酶（DNAligase）：可使一段DNA的3`羟基末端和5`磷酸末端形成3`，5`-磷酸二酯键，把两个DNA片段连在一起，封闭DNA双链上形成的切口的酶。

DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。J:\生物视频\细胞生物学视频\连接酶\DNA连接酶.swf生物视频\细胞生物学视频\连接酶\DNA连接酶.J:\生物视频\细胞生物学视频\连接酶\连接酶.swf生物视频\细胞生物学视频\连接酶\连接酶.swf第三十三页，共七十四页，编辑于2023年，星期一OHP5`3`3`5`5`3`3`5`DNAligaseDNAligase连接缺刻(nick)第三十四页，共七十四页，编辑于2023年，星期一DNA连接酶连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。第三十五页，共七十四页，编辑于2023年，星期一T4DNA连接酶(ATP提供能量）和大肠杆菌DNA连接酶（NAD+提供能量）两种。2.2种类及作用机理第三十六页，共七十四页，编辑于2023年，星期一大肠杆菌的DNA连接酶

大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。第三十七页，共七十四页，编辑于2023年，星期一大肠杆菌的DNA连接酶DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合,填满双链DNA上的单链间隙后,封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。

第三十八页，共七十四页，编辑于2023年，星期一噬菌体T4DNA连接酶

噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。

第三十九页，共七十四页，编辑于2023年，星期一AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5´5´5´5´(1)(2)AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5´5´AATTC······GG······CTTAA5´5´(a)分子间连接(b)分子内连接(1)(2)ATGCTATAGCTAT4连接酶T4连接酶第四十页，共七十四页，编辑于2023年，星期一T4DNAligase的作用机理第四十一页，共七十四页，编辑于2023年，星期一第四十二页，共七十四页，编辑于2023年，星期一1)DNA连接酶不能催化两单链DNA分子连接；2)只能连接双链DNA分子的单链缺刻(nick)；3)不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的缺口（gap）。2.3使用时的注意事项第四十三页，共七十四页，编辑于2023年，星期一思考

要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。

如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？

会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就可以合成重组的DNA分子了。第四十四页，共七十四页，编辑于2023年，星期一DNA聚合酶（DNApolymerase）

J:\生物视频\细胞生物学视频\DNA聚合酶\Nucleotide_Polymerization.movJ

J:\生物视频\细胞生物学视频\DNA聚合酶\Nucleotide_Polymerization.mov3.1DNA聚合酶I3.2Klenow聚合酶3.3TaqDNA聚合酶3.4逆转录酶3.5T4DNA聚合酶3.6T7DNA聚合酶第四十五页，共七十四页，编辑于2023年，星期一3.1DNA聚合酶I活性：5`→3`聚合活性，5`→3`外切和3`→5`外切活性。发挥生物学活性的条件：（1）DNA模板（可以是单链或双链）（2）带有3`-端游离羟基的引物链（3）底物和激活剂注：对双链DNA，当有dNTP存在时，3`→5`降解活性会被5`→3`方向的聚合活性所抑制。应用：缺口平移法制备DNA分子杂交探针第四十六页，共七十四页，编辑于2023年，星期一1、5′→3′聚合酶活性：

CCGGGCTATCGGE.coliDNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG2、5′→3′外切酶活性

3、3′→5′外切酶活性

GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coliDNApolIMg2++pC，pT5′TCGATAGCCAGCTATE.coliDNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5′DNA聚合酶I的三种活性第四十七页，共七十四页，编辑于2023年，星期一DNA杂交探针的制备5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’5‘3’3‘5’********(a)(b)(c)(d)(e)(a)双链的DNA分子(b)带有3’-OH末端的单链缺口(c)polⅠ从5‘-P移去一个核苷酸(d)polⅠ将32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸(e)重复(c)(d)的步骤，缺口沿5’-3‘方向移动，形成32P标记的核苷酸合成的DNA链第四十八页，共七十四页，编辑于2023年，星期一制备高比活性的探针当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coliDNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3‘羟基末端。同时该酶具有从5’→3‘的核酸外切酶活性,能从切口的5’端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3‘端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。DNA聚合酶I在基因工程的应用第四十九页，共七十四页，编辑于2023年，星期一用于分子克隆（填充缺口利于重组）

DNApolⅠ能填充DNA的小缺口区（Gappedregion）→以便有效在体外用于DNA分子重组第五十页，共七十四页，编辑于2023年，星期一

DNA序列分析K:\生物视频\细胞生物学视频\核酸特性、合成及转运\DNA测序生物视频\细胞生物学视频\核酸特性、合成及转运\DNA测序

①

Sauger双脱氧法

DNApolⅠ参入了2’3’－双脱氧核苷酸到相应的融合了的引物中，从而终止了链的进一步延伸，这样每个大小不同片段都带有ddNTP。经过PAGE测出DNA顺序。

第五十一页，共七十四页，编辑于2023年，星期一②

化学降解法当Mg2＋被Mn2＋取代时，DNApolⅠ有参与相应NTP取代dNTP的能力，参与的这个NTP可以作为1个特殊切割位点而被降解，得到带有NTP末端的DNA片段，这是化学法测序的主要原理。③

加减法主要原理是在限制使用dNTP条件下加入DNApolⅠ和T4诱导的DNApol同时反应。在减法反应中从4个反应混合物中每4个dNTP中减去1个。生长链沿着引物延伸至缺少的那个dNTP为止。在加法反应中所用的dNTP只有1种，如dATP，通过DNApol3′→5′外切酶活性使链终止在带有A的3’末端用其它3种dNTP进行类似反应，这样通过加或减法8个混合物的电泳结果即可推出DNA链的顺序。

第五十二页，共七十四页，编辑于2023年，星期一来源：

E.coliDNAPolymeraseⅠ经蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.19703.2Klenow聚合酶DNApolⅠ枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶C端(76kd)+N端（36kd）

5’→3’外切第五十三页，共七十四页，编辑于2023年，星期一用途填补限制酶的5′-粘性末端为平齐末端5’…CC3’…GGAATT5’…CCTTAA3’3’…GGAATT5’Klenow3′-末端标记

Klenow在无底物时只进行3′→5′外切；有底物存在时则聚合。这种标记也称作交换标记，但Klenow作用不如T4DNA聚合酶。第五十四页，共七十四页，编辑于2023年，星期一显著特点：热稳定性

70℃反应2h残留活性为原来的90%；93℃反应2h残留活性为原来的60%；94℃反应2h残留活性为原来的40%。应用：（1）DNA序列测定（2）PCR(polymerasechainreaction)对DNA的特定片段进行体外扩增。K:\生物视频\细胞生物学视频\分子\PCR3.3TaqDNA聚合酶第五十五页，共七十四页，编辑于2023年，星期一逆转录酶(reversetranscriptase)：又称为RNA指导的DNA聚合酶。活性：

5`→3`聚合酶活性和RNaseH活性。聚合作用所需模板可以是RNA或DNA，引物是带3`-OH的RNA或DNA。K:\生物视频\细胞生物学视频\逆转录酶\逆转录酶的作用原理.swf生物视频\细胞生物学视频\逆转录酶\逆转录酶的作用原理.swfK:\生物视频\细胞生物学视频\逆转录酶\DNA端部处理生物视频\细胞生物学视频\逆转录酶\DNA端部处理K:\生物视频\细胞生物学视频\反转录病毒\Life_Cycle_of_a_Retrovirus.mov生物视频\细胞生物学视频\反转录病毒\Life_Cycle_of_a_Retrovirus.mov3.4逆转录酶第五十六页，共七十四页，编辑于2023年，星期一逆转录酶的活性第五十七页，共七十四页，编辑于2023年，星期一

用途：（1）在体外以mRNA为模板合成cDNA；（2）对有5`突出末端的DNA片段作末端标记（补平）；（3）双脱氧法测序；（4）以DNA或RNA为模板合成核酸探针。第五十八页，共七十四页，编辑于2023年，星期一活性：

5`→3`聚合酶活性和3`→5`外切酶活性，且3`→5`外切酶活性对单链DNA的作用比对双链DNA强。

高浓度dNTP环竟下前者活性更强。应用：标记DNA平末端或隐蔽3`末端注意：3`外切酶活性无序列特异性3.5T4DNA聚合酶第五十九页，共七十四页，编辑于2023年，星期一活性：5`→3`聚合酶活性；有单链及双链的3`→5`外切酶活性，但无5`→3`外切酶活性；特点：极佳的连续合成能力应用：（1）用于长模板DNA的引物延伸反应；（2）通过单纯的延伸或取代合成途径标记DNA3`末端；（3）使双链DNA的5`或3`突出末端变成平末端。3.6T7DNA聚合酶第六十页，共七十四页，编辑于2023年，星期一T7DNA聚合酶（测序酶）来源：T7Phage感染的E.coli结构：由2个蛋白亚基组