谷氨酰胺转胺酶对重组肥牛粘结条件及工艺的优化

谷氨酰胺转胺酶对重组肥牛粘结条件及工艺的优化郝修振;付丽伸晓琳;忤世清【摘要】针对重组肥牛组织松散，粘结性差的问题，试验利用响应面法研究TG、酪蛋白及磷酸盐组合的粘结剂对重组肥牛的品质的影响，并采用正交试验优化了重组肥牛的最佳粘结工艺条件.研究结果表明，谷氨酰胺转胺酶粘结剂配方:1.2%TG+1.44%酪蛋白+0.35%磷酸盐;最佳工艺条件为:成型后，在4~5°C下粘合4h,-20C冷冻22h,生产的重组肥牛外观、组织状态、纹理、耐煮性等能达到优质肥牛的标准.【期刊名称】《肉类工业》【年(卷)，期】2016(000)007【总页数】6页(P33-38)【关键词】谷氨酰胺转胺酶;重组;肥牛【作者】郝修振;付丽伸晓琳;忤世清【作者单位】河南牧业经济学院食品工程系河南郑州450046;河南牧业经济学院食品工程系河南郑州450046;河南牧业经济学院食品工程系河南郑州450046;河南伊赛牛肉股份有限公司河南焦作454450【正文语种】中文随着肥牛火锅行业的发展，中国的肥牛市场蓬勃发展，肥牛卷的市场需求量不断增长。优质肥牛，口感细嫩、多汁、美味且营养丰富，备受青睐。但牛胴体分割得到的优质肥牛肉数量较少，远远不能满足市场需求。所以目前市场销售的肥牛肉卷多数是用牛肉类食品加工过程中产生的碎肉，经过包裹、冷冻成型制得。由于这种肥牛卷加工技术落后，肉块间粘结性差，虽有一定的切片性，但经烹饪后即会散开，口感及风味较差，急需生产一种肉质鲜嫩、品质优良、造型别致、食之馨香的肥牛肉卷。因此，为了提高肥牛卷的食用品质，满足市场需求，生产重组肥牛卷是一个很好的方法。肉的重组技术起源于20世纪60年代［1］，采用酶法重组肉是最常用的方法。谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase，TG)是一种能催化酰基转移的酶，可使蛋白质分子间和分子内发生交联反应［2］。TG具有粘合力极强，pH值稳定性好、热稳定性强及使用安全的优点，能促进肌肉蛋白形成强有力的凝胶，从而改善其弹性、保水性、黏结性及稳定脂肪的能力［3，4］。另外，国夕卜对于TG在食品加工中的应用的报道较多，已经研究了近三十年。1989年，日本最先推出食品级TG,直接推动了TG在食品工业尤其是肉制品和乳制品的发展。国内也有相关的报道，添加0.05%的谷氨酰胺转胺酶即可以粘结羊肉卷［5］；有人将谷氨酰胺转胺酶利用于碎小虾仁以提高虾仁的价值；添加0.1%TG的注射火腿在产品质构、弹性、切片性上均有很大的提高；用去筋的碎牛肉与肥肉(含固定的脂肪成分)在0.2%~0.5%TG的作用下，蛋白粗链之间交叉链接，可制作出口感甚佳的牛排等等。本试验以新鲜牛肉为原料，以产品质构和感官为测定指标，采用L9(34)正交试验对谷氨酰胺转胺酶的最佳添加浓度及工艺条件进行了优化。然后研究了谷氨酰胺转胺酶、磷酸盐及酪蛋白复合作用的粘结剂对重组肥牛的成型效果，并利用响应面试验方法优化了重组肥牛粘结剂的最佳配比。1材料和方法1.1材料与试剂原料牛肉：伊赛牛业有限公司提供。TG:南宁庞博生物工程有限公司，最适pH值6.0，最适温度50^左右。酪蛋白、复合磷酸盐等均购于河南省华丰化学试剂有限公司。1.2仪器与设备CT3-10k质构仪，美国Brookfield公司；RGR-30VT小型真空滚揉机，嘉兴市瑞邦机械工程有限公司；HWS-26电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司。2方法2.1工艺流程2.2加工要点原料选择。选择卫生检验合格的分割牛碎肉及牛脂肪。修整。肌肉(不定部位)修去所有碎骨、软骨，顺肌肉纹理切成1~2cm厚片状。脂肪修成1cm厚片状。搅拌混匀。由于TG是一种带有半胱氨酸活性中心的-SH基酶，而SH-基团的氧化会使该酶失去活性，故在酶添加至酶反应结束需保持真空环境，因此采用真空滚揉机搅拌混合均匀，尽可能地保持酶的活力，使TG的作用效果更为理想，并且有助于盐溶性蛋白质的提取。滚揉时间40min，转速12r/min，真空度0.08MPa,环境温度0~4°C，正向20min，反向20min。成型。取成型模具，按尺寸拼入碎肉，码放平整，加入已修成1cm厚脂肪。再依次加入碎肉、片状肌肉。最终形成中间层为脂肪，2层碎肉在第二层，最外为肌肉层的五层纹理。粘合反应。将成型后肥牛肉在4~5C条件下放置一定时间，让粘合剂充分作用，发挥酶的粘结性。冷冻。将粘合好的肥牛肉放入冰箱中冷冻。冷冻既可使得谷氨酰胺转胺酶钝化失活，终止酶反应过程，又可使肥牛肉固定形状。2.3检测指标本实验的最终产品，采用质构测定和感官指标评定的方法。质构测定［6］。半融化状态下将肉块切成10mm片状，待其完全融化后用TA-XTplus质构仪TPA模式分析重组肉片的质构特性，P/36不锈钢控头。各参数设定如下：测前速度2.0mm/s；测试速度10.0mm/s；测试后速度10.0mm/s；肉片压缩至原先的30%，以肉片硬度(Hd)表示粘结力(kg)。测试在室温下完成。感官评定。产品的色泽、气味、组织状态、切片性及耐煮性由专业人员评定，实行5分制，总分为25分，见表1。表1感官评分标准Table1Sensoryevaluation项目指标要求分数色泽肉色鲜红、有光泽,脂肪乳白色颜色暗红、光泽度较低颜色呈褐色，几乎不具光泽度530气味具有正常气味气味较清淡气味差或有异味530组织状态切面细密平整切面松散且不坚实呈分散块状结构530切片性切片透明且完整切片性较差，有肉渣掉落切片性很差530耐煮性耐煮且无散开约有1/3散开有一半以上散开5302.4试验设计酶活力对肉粘结效果的研究。将处理好的牛肉，按每100g牛肉中分别添加20、40、60、80、100U/100g的酶量，将牛肉与酶一同放入真空滚揉机中，混拌均匀后，成型、粘合、冷冻。解冻后，在半融化下测定产品质构。TG添加量及工艺条件的优化。将处理好的牛肉，放入真空滚揉机中。将酶溶于少量水中制成酶液，添加酶量分别为牛肉重量的0.5%、1.0%、1.5%，均匀地喷洒在肉中，真空条件下滚揉，成型、粘合、冷冻，再解冻后在半融化下测定产品质构和感官指标。采用正交实验方法，采用谷氨酰胺转胺酶添加量、粘合时间、冷冻温度和冷冻时间4个因素，按照L9(34)正交实验表进行试验(见表2)，以确定谷氨酰胺转胺酶的最佳添加浓度及工艺条件。表2因素水平表Table2FactorsandLevelsoforthogonaltest水平因素TG添加量/%粘合时间/h冷冻温度/1冷冻时间/h10.52-1818213-202031.54-2522磷酸盐对TG粘结效果的研究。酶量以牛肉重的1.0%添加，分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%(w/w)的复合磷酸盐，以不加磷酸盐及TG组为CK组，只添加TG组为0号组。磷酸盐先与TG充分混合，再加入15mL的水搅拌成溶液，其它处理方法同上。⑷不同蛋白质对TG粘结效果的影响。添加酶量以牛肉重的1.0%，选用小麦蛋白、酪蛋白、大豆组织蛋白为添加蛋白，各种蛋白均选用0.5%、1.0%、2.0%、3.0%(w/w)浓度，以只添加TG组为0号组。各种蛋白质先与TG充分混合，再加入15mL的水搅拌成溶液，其它处理方法同上。⑸磷酸盐对酪蛋白/谷氨酰胺转胺酶体系粘结效果感官评定。向最优组合的酪蛋白/谷氨酰胺转胺酶体系中添加0.1%、0.2%、0.3%和0.4%的磷酸盐组成复合粘结剂，其它处理方法同上。以不加磷酸盐、酪蛋白和TG组为CK组，只添加酪蛋白和TG组为0号组，进行磷酸盐对酪蛋白/谷氨酰胺转胺酶体系粘结效果的感官评定。(6)粘结剂的复配优化。首先，根据单因素试验结果确定的TG、酷蛋白、磷酸盐添加量，进行响应面优化试验，以TG添加量(x1)、酪蛋白添加量(x2)、磷酸盐添加量(x3)为自变量，以产品质构(y)为响应值，优化粘结剂最佳配比。因素和水平见表3。表3响应面优化试验因素水平编码表Table3Factorsandlevelsofresponsesurfacedesign水平因素TG添加量/%x2酪蛋白添加量/%x3磷酸盐添加量/%x110.50.50.121.01.00.331.51.50.5⑺验证试验。通过响应面分析，得出粘结剂的最佳配比和预测值后，进行实际的肥牛成型试验，分别测定质构和感官品质，并与对照组进行比较和分析。2.5试验数据的统计分析每个试验重复3次，结果表示为平均数。单因素试验图表采用Sigmaplot10.0绘制，利用SPSSStatistics17.0进行显著性分析；应用Design-Expert8.0.6中的Box-BehnkenDesign模块进行响应面优化试验设计，并建立相应的回归方程，得出最佳配比。3结果与分析3.1酶活力对肥牛肉粘结效果的研究如图1所示，不同TG活力对肉粘结效果的影响。结果表明，当酶活力低于60U/100g肉时，由于酶量过低酶催化的反应不能在低温短时间内完成，肉片间虽能形成较多连接键，但是强度不足，粘结效果不十分理想。酶量超过60U/100g肉时，粘结强度有所增加但较缓慢。原因可能是TG中含有蛋白酶，能部分水解牛肉蛋白质从而影响其交联度。因此，添加60U/100g的酶对肥牛肉粘结作用是很有效的。图1酶活力对肉粘结效果的影响Fig.1Effectsofenzymeactivityonbeefmeatbondingeffect3.2TG添加量及工艺条件的优化表4分析结果表明：因素TG对指标的影响高度显著，粘合时间影响显著，而冷冻温度和冷冻时间相对前两个因素影响量不显著。由表4可知，最佳实验方案是：TG添加量1.0%，粘合时间4h，冷冻温度-20°C,冷冻时间22h。表4正交试验结果Table4Resultsoforthogonalexperiment试验号因素ATG添加量/%日粘合时间/hC冷冻温度/1。冷冻时间/h评分指标感官评分11(0.5)1(2)1(-18)1(18)1721(0.5)2(3)2(-20)2(20)1831(0.5)3(4)3(-25)3(22)1942(1)1(2)2(-20)3(22)2552(1)2(3)3(-25)1(18)2262(1)3(4)1(18)2(20)2573(1.5)1(2)3(-25)2(20)1883(1.5)2(3)1(-18)3(22)1893(1.5)3(4)2(-20)1(18)19K11920.32019.8K224.319.32120.3K318.32119.621单指标优组合A2B3C2D3Rj61.71.41.2单指标因子主次ABCD由感观评分结果发现：谷氨酰胺转胺酶对于肥牛肉片之间的粘合是非常有效的。添加谷氨酰胺转胺酶对于肥牛的组织状态、切片性、耐煮性等都有很大程度的改善。但是谷氨酰胺转胺酶的添加量大于1.5%时，对于成品的质地却起到负面影响，估计还是其中蛋白酶对肉蛋白质的水解作用造成交联度下降。3.3磷酸盐对TG粘结效果的影响从图2结果来看，CK组粘结力只有0.4kg，只添加TG组粘结力为0.82kg，而添加磷酸盐组比以上二者粘结力明显增大(p<0.01)。原因是具有多价离子的磷酸盐的添加，提高了离子强度，诱导牛肉中盐溶性蛋白尤其是肌球蛋白的大量溶出至牛肉片表面。再有，肌球蛋白是TG较好的作用底物［7］，该酶作用下肉片表面的肌球蛋白分子之间发生共价作用，达到交联粘结效果。同时磷酸盐也会提高肉的pH值，使酶的活性增强。因此，考虑到磷酸盐添加对肉风味和色泽的影响，采用磷酸盐添加量为0.3%。图2磷酸盐对TG粘结效果的影响Fig.2EffectsofphosphateonbeefmeatbondingeffectofTG3.4不同蛋白质对TG粘结效果的影响由图3可知，效果最佳的粘结剂组合为1.0%的酪蛋白与1.0%TG，效果明显好于大豆组织蛋白和小麦蛋白(p<0.05)，这与Ikura等人的研究结果一致，而且肥牛经过煮制时不会散开，粘结性明显好于仅用磷酸盐和TG组成的粘合剂(p<0.05)。原因是大量的赖氨酸残基存在于酪蛋白，赖氨酸残基为TG最好作用受体。图3不同蛋白对粘结效果的影响Fig.3EffectsofdifferentproteinonbeefmeatbondingeffectofTG3.5感官指标经评定得产品综合评分如表5所示。添加0.3%磷酸盐的组经感官评定，色泽、气味、组织状态及切片耐煮性均非常好。当磷酸盐的量达到0.4%时，产品的气味和组织状态显著差于其他组。综合考虑选用磷酸盐的添加量为0.3%。表5不同配比的感官评分Table5Sensoryevaluationresultswithdifferentproportion组别色泽气味组织状态切片性耐煮性总分CK组5±0.71a5±1.00a0±0.00a0±0.00a0±0.00a10±1.58a对照组5±1.27a4.9±1.02a1.1±0.74b3±0.71b3.1±0.74b17.1±2.53b15±1.48a5±1.00a3±1.04ce4.1±0.74c4.2±0.84b21.2±2.95ce25±0.71a5±1.00a4.1±0.89cd4.3士0.45c4±1.00b22.4±1.67cd35±0.71a5±0.00a4.3±0.67cd5±0.71c5±1.00b24.3±1.79cd44±1.30a3.4±0.55b3.3±0.45e5±0.55c5±0.35b21.5±2.03e3.6磷酸盐对酪蛋白/TG体系粘结效果的影响(1)响应面优化试验结果。见表6,表7。表6响应面试验设计与结果Table6Designandresultsofresponsesurfacemethodology序号ABCY/%10.500.500.301.01021.001.000.301.20031.001.000.301.20340.501.000.100.65450.501.000.500.84761.000.500.100.98870.501.500.300.75681.501.000.100.98791.501.500.301.224101.001.500.101.014111.000.500.501.001121.001.000.301.201131.001.000.301.202141.500.500.300.835151.501.000.501.104161.001.500.501.247171.001.000.301.312采用响应面方法分析试验结果，得到以粘结力为响应值的回归方程：Y=1.22+0.11A+0.051B+0.070C+0.16AB-0.019AC+0.055BC-0.22A2-0.051B2-0.11C2表7肥牛粘结剂优化数据模型方差分析Table7Mathematicalmodelvarianceanalysisfor4#fatbeefbinderoptimization变异来源平方和自由度均方F值P值显著性模型0.55090.06118.160.0005**A0.09710.09728.840.0010**B0.02110.0216.130.0425*C0.03910.03911.430.0117*AB0.10010.10030.580.0009**AC0.00010.0000.430.5342BC0.01210.0123.580.1004A20.20010.20058.090.0001**B20.01110.0113.290.1124C20.05110.05114.990.0061**残差0.02470.000失拟项0.01430.0001.890.2718纯误差0.00040.000总回归0.5816注：**极显著(p<0.01),*显著(p<0.05)。由表7可见，由方差分析可看出以质构(Y)为响应值的二次方程具有显著性(p<0.05)，而失拟项的p值=0.2718>0.05，故其不显著；而且该模型的决定系数R2=0.9321，说明该方程拟合程度良好，实验误差小。一次项中TG添加量影响极显著，酪蛋白、磷酸盐添加量影响显著，这与单因素实验结果保持一致；各因素的交互作用中TG添加量和酷蛋白影响显著，；二次项中TG添加量、磷酸盐添加量影响极显著。各因素对肥牛粘结力的影响大小为TG>磷酸盐>酪蛋白。根据响应面分析建立的数学模型，得到的最佳工艺条件是TG添加量1.2%，酪蛋白添加量1.44%，磷酸盐添加量0.35%。在此条件下肥牛的粘结力的预测值为1.32kg。(2)验证实验。由响应面分析，得出肥牛粘结剂水的最佳配比是TG1.2%，酷蛋白1.44%，磷酸盐0.35%。在此条件下肥牛的粘结剂的预测值为1.32。在给出的模型中，按实际操作确定的是TG1%，酪蛋白1%，磷酸盐0.3%的配比下对肥牛进行重组粘结处理，在此配比下做5组平行实验，检验模型的准确性，得出的粘结力为1.30%，试验验证值接近模型的预测值，证明模型可以较好的预测粘结处理对肥牛的成型效果。4结论TG作为一种优良的蛋白交联剂，添加少量的TG就能明显提高重组肥牛的品质，提高牛肉蛋白的凝胶强度和黏结强度，从而改善了产品的口感及质构。经过实验证明：以牛肉为原料，添加60U/100g1.2%谷氨酰胺转胺酶、1.44%酪蛋白和0.35%磷酸盐后，经真空滚揉搅拌均匀，再成