分子生物学教学课件：分子生物学实验-实验操作

重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建分子生物学实验-实验操作基因、载体、受体菌株基因载体菌株质粒酶切连接转化质粒提取PCR实验技术要求应掌握的实验技术酶切,连接凝胶回收制备感受态细胞质粒提取PCR琼脂糖凝胶电泳考察指标电泳、蓝白斑数量电泳感受态细胞转化率电泳电泳电泳实验流程:第一天8AM-5PM

（重组载体构建）rhIL-18基因的PCR产物载体质粒pUC18BglⅡ和PstⅠ双酶切BamHⅠ和PstⅠ双酶切浓度1%琼脂糖凝胶电泳凝胶回收纯化电泳检验T4连接酶连接过夜配制LB液体与固体平板培养基灭菌37℃过夜培养TOP10菌株溶液回收纯化实验流程:第二天8AM-5PM

（重组载体转化宿主细胞）CaCl2法制备E.Coli

JM109感受态细胞实验组连接体系42℃热激转化90s37℃温柔孵育45min涂布平板37℃过夜倒置培养实验流程:第三天1PM-5PM

（阳性转化子鉴别及转化效率检验）观察阴性对照组菌落生长情况有无菌落挑取1白色单菌落37℃液体培养基过夜培养观察阳性对照组菌落生长情况统计菌落数量计算感受态细胞转化效率观察实验组菌落生长情况统计蓝斑，白斑菌落数量观察空菌对照组菌落生长情况统计菌落数量观察空菌对照组菌落生长情况统计菌落数量第5组Ampc+第4组Ampc-实验流程:第四天8AM-5PM

（含有目的基因重组载体的鉴定）提取质粒DNAPCR浓度1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物浓度1%琼脂糖凝胶电泳BamHIPstIBglIIPst

I重组载体HybridsitePst

IBglIIPst

IrhIL-18BamHIPst

IpUC18BamH

I/

PstIBglII

/

PstIligation重组载体构建流程HybridsiterhIL-18的PCR（1）反应体系TemplateDNA2.0ul10×buffer5.0ulMgCl2（25mmol/L）6.0ulprimer1（25umol/L）1.0ulprimer2（25umol/L）1.0uldNTP（2mmol/L）4.0ulTaq酶（5u/uL）1.0ul灭菌超纯水补齐至50ul引物IL-B：ATGTCAAGATCTTACTTCGGTAAACTGGAATCTAAACTGTCTGIL-P：TGACATCTGCAGTCACTAGTCTTCGTTCTGAACGGTGAACATG

（2）PCR扩增条件：94℃4min94℃30S55℃30S30个循环72℃60S72℃10min4℃—∞双酶切反应（20μL体系）rhIL-18的PCR产物目的基因6.8μLBufferO2μL无菌水9.2μLBSA(2mg/ml)

1.0μLBglⅡ0.5μLPstⅠ0.5μL质粒pUC18质粒(PUC-18)10μL10×BamHⅠBuffer2μL无菌水6.4μLBamHⅠ(5u/ul)0.6μLPstⅠ

1μL37℃酶切反应3小时。培养基配制LB液体培养基每1L配量：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠5g滴加5NNaOH（约0.2mL），调节pH值至7.0

LB固体培养基:每100ml液体培养基添加1.5g琼脂每组准备：3个30ml液体培养基120ml固体培养基灭菌5个培养皿3个30mlLB液体培养基1个120mlLB固体培养基一个50ml离心筒微量移液器头(枪头)和EP管琼脂糖电泳琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。

DNA的分子大小琼脂糖浓度

DNA分子的构象电源电压

嵌入染料的存在

离子强度影响琼脂糖凝胶制作图示琼脂糖凝胶的配制称取0.3g琼脂糖，加入30ml1×TAE缓冲液，于微波炉中加热沸腾3次。取出稍冷后加入5μL基因染料，混匀。将凝胶倒入调平的凝胶板上，插入梳子。冷却。琼脂糖凝胶回收琼脂糖凝胶电泳检验，回收酶切产物：使用柱式凝胶回收试剂盒分别对：

目的基因片段（0.5Kb片段）溶液回收载体片段（2.7Kb片段）进行凝胶回收1.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。2.向胶块中加入3倍体积溶液GSB（如凝胶重为100mg，其体积可视为100μL，依此类推）。55℃水浴放置6–10min，间断(2-3min)温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟，直至胶块溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。（将目的基因体积补至100μL，由此补平行操作。）注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。琼脂糖凝胶回收

3.将上一步所得溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），室温放置1min，10,000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。注意：吸附柱容积为800μL，若样品体积大于800μL可分批加入。4.向吸附柱中加入650μL溶液WB，10,000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。5.将吸附柱放回收集管中，10,000rpm离心1-2min，尽量除尽残留的溶液WB。注意：溶液WB中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。6.将吸附柱置于一个干净离心管中,开盖静置1min

，使残留乙醇挥发干净。向吸附膜中间位置悬空滴加20μL溶液EB或去离子水(EB或去离子水在60-70度水浴预热,使用效果更好)，室温静置1min。

7.

10,000rpm离心1min,收集DNA溶液。平板铺制取出灭菌后的固体培养基先铺制一个平板(不含Amp、IPTG、X-Gal)留作空菌对照。每100ml瓶培养基中加入：IPTG100ulX-Gal200ulAmp100ul

再铺制4个平板连接反应⑴在灭菌的0.2mL离心管（PCR管）中进行

⑵15μL体积反应体系中：

10×快速连接缓冲液1.5μL

rhIL-18双酶切产物XμL

质粒pUC18双酶切产物YμLT4-DNA连接酶0.7μL

加水补足15μL１６℃连接过夜．酶切产物比例换算连接反应中目的基因：质粒=3：1连接反应体系中加入目的基因和质粒酶切片断的体积比=基因的亮度基因的碱基数：质粒的亮度质粒的碱基数基因的摩尔质粒的摩尔：=基因的体积质粒的体积：3×基因的碱基数×质粒的亮度基因的亮度×质粒的碱基数感受态菌的制备（1）Top10菌株37℃过夜培养以复苏菌种，取过夜培养的菌液0.6mL加入到30mLLB培养基中，37℃，230r/min振荡培养至OD600约为0.4左右(约2h)。（2）无菌条件下，将30mL菌液转移至离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。（3）在预冷4℃的离心机上以4000r/min离心10min，弃去上清，加入20mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬沉淀，冰浴上放置10min。（4）以4000r/min在4℃离心10min，弃去上清，每30mL初始培养物用1.0mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬细胞沉淀，200μL/管分装。pUC18-hIL-18重组质粒的转化（1）向分装有200μLE.coliTOP10菌株感受态细胞的EP管中加入10μL的上步中得到的连接混合物，轻轻旋转以混合内容物，冰浴上放置30min实验组1Ampc+涂100μL转化后的大肠杆菌 实验组2Ampc+涂200μL转化后的大肠杆菌阳性对照Ampc+(涂100μL)10μLpUC18（浓度0.05μg/μL）阴性对照1Ampc+感受态细胞(涂100μL)阴性对照2Ampc-感受态细胞(涂100μL)（2）将该EP管放入预加温至42℃的水浴中，放置90s，快速转移到冰浴中，使细胞冷却1~2min。（3）向EP管加入800μLLB培养基，转移至37℃摇床上，150r/min，温育45min以复苏菌株。（4）将200μL上述培养物加到含100μg/mL氨卞青霉素的LB平板上，以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺于琼脂平板表面。（5）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，37℃过夜培养；感受态细胞转化效率的计算转化子总数＝阳性对照菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)感受态细胞总数＝空菌对照菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数柱式质粒小量抽提1.取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。2.向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，使用移液器或漩涡振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。3.向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变清亮，可能由于菌体过多，裂解不够彻底，应减少菌体量。4.向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。注意：P3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。5.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。6.向吸附柱CP3中加入500μl漂洗液WB，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7.向吸附柱CP3中加入500μl漂洗液WB，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。8.将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。9.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加40μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心1min，将质粒溶液收集到离心管中。PCR鉴定阳性克隆原理PCR鉴定1、调整模板（待鉴定质粒）浓度至5ng/μL2、按下列体系配制反应混合液，混匀，TemplateDNA

1.0μLM13PrimerM4(10μmol/L)

1.0μLM13PrimerRV(10μmol/L)

1.0μLddH2O7.0μL2×TaqPCRma