真菌毒素的检测

真菌毒素的检测第一页，共三十八页，编辑于2023年，星期日第二页，共三十八页，编辑于2023年，星期日真菌毒素的种类黄曲霉素(AF)、赭曲霉素(OA)、单端孢酶烯族毒素、玉米赤霉烯酮(ZEA).真菌毒素毒性：（1）致DNA损伤，有的致癌；（2）细胞毒性，有的破坏质膜和细胞酶的作用

第三页，共三十八页，编辑于2023年，星期日第二节真菌毒素检测中样品前处理方法一、采样和样品的准备采样是真菌毒素测定中一个非常重要的步骤。1.采样的地点根据分析目的的不同确定采样地点，如：农田、仓库、加工厂、运输工具、零售商和医院等。第四页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.2.采样方法（1）静态样品的采集静态样品：麻袋、箱柜和车厢等容器存放分样品均属静态样品。采样工具：顶端尖锐的长柄采样钎子。采样数量：（1）小批量时所采麻袋数为批内麻袋数的1/4；（2）大批量时为整批麻袋数开平方（3）采样量远远超过分析所需量时，应将样品充分混合后，按四分法对角连续多次分样缩减导需要的量，一般，1000kg农产品中的采样量为几百克。第五页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.（2）动态样品的采集大批粮食在一个粮库中从一处向另一处用传送带转运时，利用商品化的十字交叉切分自动采样器从运动着的传送带上采集样品几乎可以达到真正意义上的随机取样。十字交叉切分自动采样器遵循的原则：（1）采样杯的开口应与样品流动方向垂直；（2）样品必须全部流经杯口；（3）采样杯口应足够宽

S=DLTVS：采集样品的大小；D采样口的宽度cm；L采样量kg；T：采样时间间隔s；V:为杯子运动速度，cm/s.第六页，共三十八页，编辑于2023年，星期日3.采样量采大样，按四分发对角连续多次分样缩减至1－2kg，最后取代表样全部粉碎。美国农业部USDA的方法：成批样每批取3份大样，每份22kg。第七页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.4.实验室分析用样品的采样和样品准备实验室分析用的样品为1－5kg。第八页，共三十八页，编辑于2023年，星期日二.提取1.提取溶剂溶剂的选择取决于待测毒素的种类、毒素性质、毒素在提取溶剂中的溶解度、提取溶剂的毒性价格、非测定成分在提取溶剂中的分配系数等。选用：毒性小、极性大、价格低廉的溶剂系统常用溶剂：甲醇、氯仿、丙酮、己烷、乙酸乙酯、乙睛和水中一种或多种不同配比的混合物。第九页，共三十八页，编辑于2023年，星期日2.提取温度温度影响毒素的回收率。适当升高温度可以增加毒素的回收率。第十页，共三十八页，编辑于2023年，星期日3.食品基质固体食品：选用浸剂、洗脱、索氏回流等方法。液体食品：液－液分配方法。提取酸性真菌毒素时，通常需提高提取溶剂系统中水相的PH值，使其有效地将被提取物碱化或形成水溶性碱混合物后，再进行提取。第十一页，共三十八页，编辑于2023年，星期日三.纯化纯化：在确保不损失待测毒素的前提下除去干扰杂质，过程称为纯化。常用净化方法：液－固萃取、液－液分配、化学吸附、色谱法、透析法以及SFE法等。使用最广泛的是色谱法。第十二页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.色谱法：薄层色谱法（柱色谱法最常用）吸附色谱柱常用的吸附剂：硅胶、矾土、氧化铝、活性炭、弗罗里硅土分配色谱柱常用的填充剂：硅藻土、纤维素。固相提取（广泛采用）免疫亲和柱IAC（应用于农产品的新技术）第十三页，共三十八页，编辑于2023年，星期日第三节真菌毒素的仪器分析一.薄层色谱法（TLC):1.原理样品经提取、净化、薄层分离后，某些真菌毒素在紫外光下，产生特定的荧光，以标准品作参比，根据其在薄层上显示的荧光的最低检出量来定量。适用于本身能够产生荧光的真菌毒素。如：AFB、OTA优点：经济、对设备和检验人员要求不高。第十四页，共三十八页，编辑于2023年，星期日二.高效液相色谱法（HPLC）原理：样品中的真菌毒素经柱层析分离后，通过测量色谱峰的面积定量。优点：特异性强、灵敏度高、定量准确。分析时应考虑流动相、色谱柱、柱温和检测器等分析条件，找出最佳配比。有荧光的用荧光检测器B类单端孢霉烯族化合物本身不产生荧光，但C6位置上有酮基，虽不能用HPLC配荧光检测器，但可配紫外检测器检测。第十五页，共三十八页，编辑于2023年，星期日3.应用选用液相色谱－荧光分光光度法是定量测定农产品中玉米赤霉烯酮污染最可靠、亦是最常用的方法。第十六页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.（1）玉米赤霉烯酮的测定①样品的提取用甲醇、乙醇、水混合液提取，提取液经液－液分配萃取，硅镁吸附剂柱层析纯化后，供液相色谱法检测。第十七页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.②色谱条件：液相色谱柱：125mm×4.6mm（内径），不锈钢制，内填5umODS，操作时柱前串联安装40mm×4.6mm内径、填料20umODS的保护柱，，用反向柱ODS分离，流动相为甲醇或甲醇与水混合液。第十八页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.③测定方法收集上述样品提取液，用旋转蒸发仪在40度下挥发掉有机溶剂，用甲醇定容至一固定体积，取适量提取液注入到液相色谱仪中，通过工作站得到检测值。流动相:甲醇、水混合液提取,流速0.6mL/min,荧光分光光度检测器波长：276nm，发射波长：460nm，检测波长：236nm④测定结果。第十九页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.（2）伏马菌素的测定由于伏马菌素的极性较大，一般采用强极性溶剂萃取，然后用固体吸附剂去除杂质，将洗脱剂蒸干后，用甲醇溶解残渣供分析用。第二十页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.①色谱条件流动相：乙睛－水－三氯乙酸（5：95：0.025）C18柱为分离柱波长：230nm直接进行紫外检测，乙睛－水（80：20）为流动相，流速1mL/min，进样量5uL。②测定结果第二十一页，共三十八页，编辑于2023年，星期日三.气相色谱法（GC）1.研究进展单端孢菌毒素的GC分析方法得到广泛应用。主要用于分析分子中不含发色集团和荧光基团，或具有弱荧光或弱吸收的真菌毒素。第二十二页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.2.应用（1）赭曲霉素的GC测定赭曲霉毒素A首先被转化成邻甲基赭曲霉毒素A甲醚衍生物，然后用毛细管GC－NICI-MS进行鉴定，定量分析时，要使用多离子检测和六氘化赭曲霉毒素A甲醚作为内标，MS电离方法是负离子化学电离。第二十三页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.（2）GC（电子捕获器）测定10种单端孢霉烯族毒素。（3）GC测定A类单端孢霉烯族真菌毒素的所有方法比较第二十四页，共三十八页，编辑于2023年，星期日四.免疫化学分析法免疫反应：就是指抗原和抗体分子的结合，这种结合形式可以是游离的，也可以结合在细胞表面，抗原抗体复合物的形成要求二者分子结构有互补性、抗原与抗体的结合也因此具有高度特异性。优点：高度特异性、高灵敏度、快速简便等。可以在组织、细胞和生物分子等上应用。第二十五页，共三十八页，编辑于2023年，星期日..免疫化学分析方法放射免疫检测法酶联免疫吸附法（ELISA）第二十六页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.1.放射免疫检测标准品经同位素标记后与样品混合，加入定量特异性抗体后对抗原抗体复合物的放射性计数，根据结果计算样品种的抗原浓度，复合物的放射性强度与样品种的抗原浓度成正比。优点：特异性强、灵敏度高缺点：使用放射性标准品、有放射性污染，标准试剂寿命短，必须与液体闪烁计数器等昂贵仪器联合使用，不便在基层推广。第二十七页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.2.酶联免疫吸附法优点：灵敏、操作简便、样品前处理无需净化。第二十八页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.（1）酶联免疫吸附法检测真菌毒素的技术要点：第一，抗原（抗体）能结合到固相载体的表面并保持免疫活性；第二，抗体（抗原）与酶结合所形成的结合仍然保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原（抗体）反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，颜色的深浅可定量抗原（抗体）的含量。第二十九页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.要使ELISA测定结果准确，必须按规定的方法制备试剂。一般试剂：包被缓冲液、洗涤液、标本稀释液、结合物稀释液、底物工作液和酶反应终止液等。第三十页，共三十八页，编辑于2023年，星期日ELISA测定方法①加样②保温③洗涤④比色第三十一页，共三十八页，编辑于2023年，星期日第四节常见真菌毒素的结构、性质及其检测方法一.黄曲霉素毒性：致癌性、致突变性、致畸形均居首位。无色、无嗅、无味，易溶于黄曲霉素的检测（视频）：ELISA第三十二页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.（2）赭曲霉毒素毒性：主要对肾产生危害，造成肾肿大，当浓度超过5mg/kg时，对肝脏组织和肠道产生破坏，引起肠炎等。无色结晶化合物，易溶于极性溶剂和稀的碳酸氢钠水溶液肿，微溶于水，在紫外光照射下，呈绿色荧光，该化合物稳定，在乙醇中置冰箱避光保存一年以上而不破坏，但在谷物中随时间延长而降解。存在于：粮谷物、大豆、葡萄及葡萄酒、咖啡、可可和巧克力、中草药、调味料、啤酒等。检测方法：液相色谱法、薄层层析法第三十三页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.（3）杂色曲酶毒素毒性：引起肿瘤污染：小麦、大麦、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等。易溶于氯仿、苯、吡啶、乙睛和二甲基亚砜，微溶于甲醇、乙醇，不溶于水和碱性溶液。在紫外线照射下，具有砖红色荧光。检测方法：薄层法，紫外分光光度计测定第三十四页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.（4）伏马菌素自然界中最为普遍，毒性强，损伤肝肾功能。白色粉末，易溶于水、甲醇、乙睛等溶剂中，在甲醇溶液中不稳定，在乙睛水溶液中非常稳定。检测方法：高效液相色谱法第三十五页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.（5）单端孢霉烯族化合物头孢菌、镰孢菌、木霉菌等。侵害玉米、小麦、大米、燕麦、大麦等。无色结晶、在常温下非常稳定，难溶于水，溶于极性溶剂，在烹调等加热过程中不会被破坏，在紫外光下不显荧光。但T-2毒素在紫外光下产生一种具有蓝色荧光物质检测方法：薄层法第三十六页，共三十八页，编辑于2023年，星期日.（6）玉米赤霉烯酮禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、木贼镰刀菌具有类似雌激素的作用，可与雌激素受体结合而影响细胞核的雌激素转录，刺激含雌激素受体的乳腺癌细胞的增长。是一种白色结晶化合物，不溶于水、二硫化碳禾四氯化碳，微溶于石油醚（30－60），溶于碱性