生物工业菌种与种子的扩大培养

生物工业菌种与种子的扩大培养第一页，共九十六页，编辑于2023年，星期日本章内容一、工业生产常用的微生物及要求二、工业微生物菌种的选育与改良三、工业微生物菌种的衰退、复壮和保藏四、种子的扩大培养第二页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第一节工业生产常用微生物及要求一、工业生产常用的微生物工业上用的微生物主要有六类：1．细菌（bacteria）例：枯草芽孢杆菌、乳杆菌2．酵母菌（yeast）例：啤酒酵母3．霉菌（mould）例：曲霉、青霉第三页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第一节工业生产常用微生物及要求一、工业生产常用的微生物工业上用的微生物主要有六类：4．放线菌（actinomyeetes）

主要是生产各种抗生素。例：链霉菌生产链霉素；小单孢菌生产庆大霉素。5．担子菌（basidiomycetes）也就是菇类。例：灵芝、香菇6．藻类（alga）一类自养性生物。例：螺旋藻、蓝绿藻第四页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第一节工业生产常用微生物及要求

二、微生物工业对菌种的要求具备四个条件：原料廉价、生长迅速、目的产物产量高；易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短；抗杂菌和噬菌体的能力强；菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不生产任何有害的生物活性物质和毒素，保证生产安全。第五页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第二节工业微生物菌种的选育与改良微生物筛选基因突变（菌种选育）基因重组（菌种改良）基因直接进化自然选育（非定向筛选）诱变育种杂交原生质体融合DNA重组（半定向筛选）点突变易错PCR同序法DNAshuffling(体外同源重组)（定向筛选）第六页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第二节工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育1.定义(1)自然选育在生产过程中，不经过人工诱变处理，而根据菌种的自发突变进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或者自然分离。用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变，从而进行的筛选，称为诱变育种。(2)诱变育种第七页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第二节工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育2.两者间的区别(1)选育过程自然选育：被动选择，不对菌体做任何人工处理诱变育种：主动选择，对菌体施加人工影响(2)选育效果要达到相同的水平，诱变育种所需要的时间要比自然选育的时间短很多；对选育工艺而言，一般先对菌群做自然选育；然后再做诱变育种，使其生产性能进一步提高。第八页，共九十六页，编辑于2023年，星期日一、工业微生物菌种的选育3.自然选育自然选育又可以分为两种情况：从自然界中分离获得菌株从自发突变体中获得菌株（重点）第二节工业微生物菌种的选育与改良第九页，共九十六页，编辑于2023年，星期日一、工业微生物菌种的选育从自然界中分离获得菌株一般过程：土样（水样）的采集预处理

增殖培养纯种分离产品的鉴定及筛选复筛较优菌株1-3株生产性能测试初步工艺条件摸索保藏、进一步做生产试验或作为育种的出发菌株某些必要试验和毒性试验等第二节工业微生物菌种的选育与改良第十页，共九十六页，编辑于2023年，星期日土样（水样）的采集地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布情况以及菌种的主要特征与外界环境关系等进行综合、具体的分析来决定。I.地点的确定一般的话，可以从土壤中采样，种类是最多的。II.采样的操作方法用小铲除去表层土壤，取离地面5-15cm处的土样，放入预先消毒好的塑料袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况等，以备日后考查。第十一页，共九十六页，编辑于2023年，星期日预处理处理土样，为即将进行的培养做准备。I.目的II.操作方法如果是水样，则不需要再制备悬液；如果是土样，则将采集的土样按一定的比例溶解在去离子水中，振荡搅匀，制成样品悬液。等待划线。一般制成10-2菌悬液，也就是1g土样放入99ml去离子水中。第十二页，共九十六页，编辑于2023年，星期日增殖培养针对目标菌株可能较少、杂菌较多而进行。操作目的是为了增加目标菌株的数量；如果目标菌株较多，则没有必要，直接分离即可。I.目的II.定义给混合菌种提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，有利于分离，也叫富集培养。第十三页，共九十六页，编辑于2023年，星期日增殖培养(i)定向培养III.富集培养的方案采用特定的有利于目的微生物富集的条件进行培养。使用专一性底物、pH条件、培养时间以及培养温度都是定向培养的方法。第十四页，共九十六页，编辑于2023年，星期日增殖培养III.富集培养的方案(ii)从菌种的分类学角度考虑目标菌种分离方法细菌霉菌放线菌培养基中添加浓度一般为50μg/ml的抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生长分离培养基中加入一定的抗生素，如青霉素和链霉素，抑制细菌生长悬液中加入10%的酚数滴，就可以抑制霉菌和细菌的生长第十五页，共九十六页，编辑于2023年，星期日III.富集培养的方案(iii)随机分离从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。增殖培养第十六页，共九十六页，编辑于2023年，星期日纯种分离单菌落分离法分离方法：具体的操作主要有稀释分离法和划线分离法两种。I.稀释分离法操作步骤：①将样品不断的稀释，使其分散到最低限度②然后将稀释液涂布于培养基平板上进行培养③待长出独立的单个菌落，进行挑选分离。优势：在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的概率大。第十七页，共九十六页，编辑于2023年，星期日I.稀释分离法单菌落第十八页，共九十六页，编辑于2023年，星期日单菌落分离法分离方法：II.划线分离法操作步骤：①首先倒培养基平板②然后用接种针（接种环）挑取样品，在平板上有规则的划线。优势：简单、快捷注意点：

采用单菌落分离法要注意菌体的分散度。有不同的菌体长在一起的话，有时会发生吻合现象，形成异核菌落。纯种分离第十九页，共九十六页，编辑于2023年，星期日II.划线分离法斜线法曲线法方格法放射法四格法第二十页，共九十六页，编辑于2023年，星期日产品鉴定及筛选从两个角度出发：产物角度、形态角度I.从产物角度出发也就是在培养时以产物的形成来有目的的设计培养基。例：醛肟水解酶的筛选在培养基中加入0.05%的Z-PAOx，每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基，不断分析样品。第二十一页，共九十六页，编辑于2023年，星期日II.从形态角度出发也就是观察菌落的外观形态，它是微生物的一个重要表征。例：多糖产生菌在适当的培养基上生长时，产生粘液性的菌落产品鉴定及筛选从两个角度出发：产物角度、形态角度第二十二页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第二节工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选产生菌：嗜碱芽孢杆菌

自然选育过程：(a)采样：造纸厂土样(b)预处理：1g土样溶于99ml去离子水中，振荡均匀，过滤，得菌悬液(c)增殖培养：经80℃，30分钟预处理第二十三页，共九十六页，编辑于2023年，星期日自然选育过程：(e)鉴定筛选：选择有凹陷圈的菌落，而且越大越好，得到初筛菌种。(f)复筛：通过生产性能测试，摸索条件，分析产酶率，得到1-3株较好菌株(g)保藏及进一步育种第二节工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选(d)分离纯化：固体分离培养基采用CMC为唯一碳源，pH10.5条件下涂布培养3-4天第二十四页，共九十六页，编辑于2023年，星期日4.诱变育种定义：通过诱变剂处理菌种，大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株，称为诱变育种。原理：采用物理、化学等诱变因素使微生物DNA碱基对排列发生变化，造成突变，从而使细胞功能发生改变。第二节工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育第二十五页，共九十六页，编辑于2023年，星期日突变方向正突变负突变对生产有利的突变称为正突变。造成菌株衰退及生产质量下降的突变称为负突变。菌株发生正突变的概率低。诱变育种的关键：以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液，使个别存活的个体中DNA碱基变异频率大幅提高；4.诱变育种第二节工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育第二十六页，共九十六页，编辑于2023年，星期日优势：方法简便、工作速度快、效果显著。用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，培育优良高产菌株。意义：诱变育种不仅能提高菌种的生产性能，而且能改进产品的质量、扩大品种和简化生产工艺等。4.诱变育种第二节工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育第二十七页，共九十六页，编辑于2023年，星期日诱变育种的一般程序：出发菌株的选择菌悬液制备前培养诱变中间培养变异菌株分离筛选4.诱变育种第二节工业微生物菌种的选育与改良一、工业微生物菌种的选育第二十八页，共九十六页，编辑于2023年，星期日出发菌株的选择1、定义工业上用来进行诱变或基因重组育种处理的起始菌株称为出发菌株(parentstrain)。2.满足要求对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高第二十九页，共九十六页，编辑于2023年，星期日出发菌株的选择3.出发菌株种类出发菌株特点从自然界中分离得到的野生型菌株自发突变经筛选得到的高产菌株（√）已诱变过的菌株对诱变因素敏感，容易发生变异与野生型菌株较相象，容易达到较好的诱变效果多次诱变可能效果迭加，积累更多的提高，但难度大第三十页，共九十六页，编辑于2023年，星期日菌悬液的制备方法：同步培养法在诱变育种中，处理材料一般采用生理状态一致的单倍体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态，称为同步培养。第三十一页，共九十六页，编辑于2023年，星期日菌悬液的制备同步化方法：菌种培养方法细菌霉菌放线菌一般要求培养至生长旺盛的对数期，变异率较高，重复性好使用刚刚成熟的分生孢子（将其放在液体培养基中短时间培养，使孢子孵化，处于活化状态，并恰好未形成菌丝体，易于诱变。）第三十二页，共九十六页，编辑于2023年，星期日菌悬液的制备具体操作：关键是制备一定浓度的分散均匀的单细胞或单孢子悬液。(1)细胞的同步培养；(2)过滤或离心、洗涤，并收集菌体；(3)配制菌悬液第三十三页，共九十六页，编辑于2023年，星期日菌悬液的制备具体操作：(i)用生理盐水或缓冲溶液配制；注意点：(ii)应注意分散度；(iii)最后制得的菌悬液，霉菌孢子或酵母菌细胞的浓度大约为106~107个/ml，放线菌和细菌的浓度大约为108个/ml。第三十四页，共九十六页，编辑于2023年，星期日前培养诱变处理前，可以在加入嘌呤、嘧啶等碱基或酵母膏的培养基中培养20-30min。前培养可以使变异率大幅提高。第三十五页，共九十六页，编辑于2023年，星期日诱变定义：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。诱变剂种类1.诱变剂物理诱变剂化学诱变剂紫外、X射线、γ射线、α射线、β射线、等离子、快中子、超声波等甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)第三十六页，共九十六页，编辑于2023年，星期日诱变2.诱变机理核酸物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子将被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而造成突变。因此，紫外线的诱变作用是由于它引起DNA分子结构变化而造成的。第三十七页，共九十六页，编辑于2023年，星期日诱变2.诱变机理这种变化包括：DNA链的断裂，DNA分子内和分子间的交联形成嘧啶二聚体。第三十八页，共九十六页，编辑于2023年，星期日诱变3.诱变仪器265nm的紫外光，对应于功率为15W的紫外灯4.诱变操作(1)将10ml菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器；(2)使用15W的紫外灯管，照射距离为30cm左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理10min左右。第三十九页，共九十六页，编辑于2023年，星期日诱变5.注意点(1)为准确起见，照射前紫外灯应先预热20~30min，然后再进行处理；(2)不同的微生物对于紫外线的敏感程度不一样，诱变剂量也不同。目前趋向采用低剂量、长时间处理；(3)为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选。第四十页，共九十六页，编辑于2023年，星期日中间培养1.目的对于刚经诱变剂处理过的菌株，有一个表现迟滞的过程（生理延迟），需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现不同变异菌体同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。2.后果第四十一页，共九十六页，编辑于2023年，星期日中间培养3.操作诱变处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，稳定的变异就会显现出来。一般也就是过夜。第四十二页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选1.目的从诱变后的突变菌体中将少数发生正突变的菌体挑出来。2.分离筛选过程（以营养缺陷型突变体的筛选为例）(1)淘汰野生型菌株(富集培养)几个定义营养缺陷型菌株

通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质的能力，必须在其基本培养基中加入相应缺陷的营养物质才能正常生长繁殖的变异菌株。第四十三页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选(1)淘汰野生型菌株(富集培养)基本培养基(MM)凡是能满足野生菌株正常生长的最低成分的合成培养基。完全培养基(CM)

在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质，如蛋白胨、酵母膏等，能满足各种营养缺陷型菌株生长繁殖的培养基；第四十四页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选补充培养基(SM)在基本培养基中只是有针对性的加入某一种或某几种自身不能合成的有机营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养基。(1)淘汰野生型菌株(富集培养)第四十五页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选分离方法：采用抗菌素法或菌丝过滤法菌种采用方法原理细菌酵母丝状真菌、霉菌、放线菌抗生素法菌丝过滤法青霉素制霉菌素野生型菌株能在MM中生长，而缺陷型不能生长，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于“休眠状态”，这时，加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。在基本培养基中，野生型的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型则不能。因此将诱变处理后的孢子在基本培养基中培养一段时间后，再进行过滤。第四十六页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选(2)检出缺陷型(分离纯化)目的：从淘汰野生型之后的混合菌株中筛选出纯的缺陷型菌株。方法：影印法、夹层法、逐个检出法、限量补充培养法第四十七页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选(2)检出缺陷型(分离纯化)影印法检出缺陷型的操作将诱变处理后的细胞涂布在完全培养基（CM）表面上，经培养后长出菌落；然后用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块覆盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具，将长出菌落的平皿倒转过来，在丝绒上轻轻按一下，转接到另一基本培养基（MM）平板上；第四十八页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选(2)检出缺陷型(分离纯化)影印法检出缺陷型的操作经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。如果发现前一平板上某一部位长有菌落，而在后一培养基上的相应部位却没有，就说明这是一个营养缺陷型菌落。第四十九页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选影印法图例(2)检出缺陷型(分离纯化)第五十页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选(3)确定生长谱(产品鉴定)方法：随机筛选、形态筛选以及理性化筛选随机筛选：菌种经过诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，从中筛选高产菌株。形态筛选：一种半理性化的筛选方式。利用形态突变直接淘汰低产变异菌株，或利用平皿反应直接挑取高产变异菌株。第五十一页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选形态筛选方法形态突变某些菌株的形态和生产性能直接相关，可以采用此种方法。如灰黄霉素产生菌。(3)确定生长谱(产品鉴定)第五十二页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选理性化筛选分为两种情况：初级代谢产物高产菌株的筛选、次级代谢产物高产菌株的筛选。平皿反应平皿反应是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物在培养基平板上作用后表现出一定的生理效应，如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等，这些效应的大小表示变异菌株生产活力的高低，以此作为筛选的标志。(3)确定生长谱(产品鉴定)形态筛选方法第五十三页，共九十六页，编辑于2023年，星期日联系区别初级代谢次级代谢①初级代谢是次级代谢的基础，它可以为次级代谢产物合成提供前体物和所需要的能量；②次级代谢途径并不是独立的，与初级代谢途径有密切关系，是它的延伸或支路。定义产物合成期能使营养物质转换成细胞结构物质、维持微生物正常生命活动的生理活性物质或能量的代谢。为了避免在初级代谢过程中某些中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。生长繁殖所必需，如氨基酸、核苷酸、维生素，酶、辅酶非生长繁殖必需，如抗生素、毒素、甾体化合物等随菌体生长不断的合成通常在细胞生长后期形成第五十四页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选(3)确定生长谱(产品鉴定)初级代谢产物高产菌株的筛选例：如何从缺陷型菌种中筛选能够积累C的高产菌株？思路：了解涉及C这种物质在菌体中的代谢途径ABCDE(i)C为中间产物，正常途径不可能积累；两个结论：(ii)E为终产物，生长必需；第五十五页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选思路：分析积累C在代谢途径中的可能性(ii)切断C→D，代谢终止，终产物E不能继续合成；(i)若要积累C，必须切断C→D的代谢；(iii)E生长必需，若不能合成，菌体无法生存；ABCDE小结：若想达到既能累积C，又能保持菌体不断生长的目的，可在切断C→D之后，人工添加E。(3)确定生长谱(产品鉴定)第五十六页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选(3)确定生长谱(产品鉴定)思路：分析积累C在代谢途径中的可能性生物反应具有一个特点：ABCDE反馈抑制现象也就是说，即使C→D切断后，C的积累量也不可能很多；而E的添加量也不能很大解决方案总的原则：绕过反馈抑制第五十七页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选(3)确定生长谱(产品鉴定)解决方案筛选类型思路方法原理初级代谢产物高产菌株的筛选需要绕过反馈调节a.降低终产物浓度b.筛选抗反馈突变菌株c.控制细胞膜渗透性利用营养缺陷型积累中间代谢物，采用低浓度终产物供给在含有抗代谢物（结构类似物）的培养基中培养，筛选抗性突变株，其中一些可分泌大量末端产物通过生理学或遗传学方法，改变膜透性，使胞内代谢物迅速渗漏到胞外，解除反馈抑制第五十八页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选结构类似物：在化学和空间结构上与代谢中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。第五十九页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选(3)确定生长谱(产品鉴定)具体操作两种方法：(i)将缺陷型菌株培养后，收集菌体，洗涤培养基，制备成细胞悬液后，与MM培养基（融化并凉至50℃）混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的5~6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组织营养物的滤纸圆片，培养后若在组合区长出，就可测得营养缺陷类型。第六十页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选(3)确定生长谱(产品鉴定)具体操作两种方法：(ii)以不同组合的营养混合物与融化凉至50℃的MM培养基铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于相应位置，培养后根据菌种在什么组合长出可推知其营养缺陷类型。第六十一页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选(3)确定生长谱(产品鉴定)例：黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制初级代谢产物产生菌的筛选(i)Thr、Lys生长繁殖必需；(ii)Thr和Lys共同反馈抑制ASP激酶；(iii)Lys反馈抑制双氢吡啶合成酶；第六十二页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选(3)确定生长谱(产品鉴定)例：黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制初级代谢产物产生菌的筛选思路：(i)切断天冬氨酸半醛→高丝氨酸途径，并低浓度添加Thr；(ii)筛选Lys的抗反馈突变菌株；第六十三页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选(3)确定生长谱(产品鉴定)例：黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制初级代谢产物产生菌的筛选操作：(i)筛选Thr营养缺陷性菌株；(ii)在培养基中加入Lys的结构类似物AEC，筛选生长旺盛的抗反馈突变菌株；第六十四页，共九十六页，编辑于2023年，星期日变异菌株的分离和筛选(3)确定生长谱(产品鉴定)例：黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制结果：诱变菌株名称缺陷型Lys产量（g/L）As1.495Leu-2.1F6-16Leu-，Thr-20.8F9-50Leu-，Thr-，AECr33.5第六十五页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第二节工业微生物菌种的选育与改良二、生产菌种的改良方法有3种：杂交育种、原生质体融合以及DNA重组改良方式定义优势杂交育种常规杂交育种原生质体融合将两个基因型不同的菌株经细胞的互相联结或原生质体融合使遗传性状会出现重新组合，然后经分离和筛选，获得符合要求的生产菌株。克服原有菌种生活力衰退的趋势；遗传物质重新组合，菌种对诱变剂更为敏感。二亲株的细胞质和细胞核进行合二为一的过程，因此遗传物质的交换更为完整，提高菌株产量的潜力更大。第六十六页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第二节工业微生物菌种的选育与改良二、生产菌种的改良方法有3种：杂交育种、原生质体融合以及DNA重组改良方式定义优势DNA重组是一个将含目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，转入一个受体细胞并使之扩增、表达的过程。更有目的性和方向性，效率更高。第六十七页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第二节工业微生物菌种的选育与改良二、生产菌种的改良DNA重组过程(a)目的基因的获得；(b)载体的选择；(c)含目的基因的DNA片段克隆入载体中构成重组载体；(d)将重组载体引入宿主细胞内进行复制、扩增；(e)筛选出带有重组目的基因的转化细胞；(f)鉴定外源基因的表达产物；第六十八页，共九十六页，编辑于2023年，星期日目的基因的获得一般有四条途径：(i)从生物细胞中提取、纯化染色体DNA并经适当的限制性内切酶部分酶切；(ii)经反转录酶的作用由mRNA在体外合成互补DNA(cDNA)，此主要用于真核微生物及动，植物细胞中特定基因的克隆；(iii)化学合成，主要用于那些结构简单、核苷酸顺序清楚的基因的克隆；(iv)从基因库中筛选、扩增获得，目前认为是取得任何目的基因的最好和最有效的方法。第六十九页，共九十六页，编辑于2023年，星期日载体的选择基因工程中所用的载体系统主要有各种质粒（细菌质粒、粘性质粒、酵母菌质粒）、λ噬菌体以及动物病毒等。载体一般为环状DNA，能在体外经限制酶及DNA连接酶的作用同目的基因结合成环状DNA质粒pBR322第七十页，共九十六页，编辑于2023年，星期日重组载体DNA体外重组是将目的基因用DNA连接酶连接到合适的载体DNA上，可采用粘端连接法和末端连接法。第七十一页，共九十六页，编辑于2023年，星期日引入宿主质粒为载体的重组DNA以转化方式进入宿主细胞；以噬菌体为载体以转染方式进入；柯斯质粒以转导方式进入。第七十二页，共九十六页，编辑于2023年，星期日筛选转化细胞根据导入基因的表达产物来筛选。转化子能在氨苄青霉素及四环素培养基中生长转化子只能在氨苄青霉素培养基中生长第七十三页，共九十六页，编辑于2023年，星期日基因工程菌的获得经重组DNA的转化与鉴定，得到符合“设计蓝图”的工程菌。第七十四页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第二节工业微生物菌种的选育与改良二、生产菌种的改良DNA重组实例：天冬酰胺酶II在大肠杆菌中的高效表达(i)宿主的选择：大肠杆菌菌株DH5α

(ii)目的基因的选择：EC-II的基因ansB序列是已知的，通过基因库可以查到。(iii)载体的选择：高效原核表达载体pBV220(iv)引物的设计：P1:5’-GGAATTCCATGTTACCCAATATCACCATT-3’P2:5’-CGGATCCGATGGACGTGAGTCTG-3’第七十五页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第二节工业微生物菌种的选育与改良二、生产菌种的改良DNA重组实例：天冬酰胺酶II在大肠杆菌中的高效表达(v)ansB的PCR扩增：PCR循环参数为：94℃变性1min、55℃复性1min、72℃延伸1min，30个循环，最后一个循环，72℃延伸5min。(vi)重组载体的构建：将载体pBV220与ansB通过T4连接酶连接，得到pBV-EC；(vii)引入宿主细胞：将重组表达质粒pBV-EC转化进大肠杆菌DH5α，得到重组表达菌株DH5α/pBV-EC，第七十六页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第二节工业微生物菌种的选育与改良二、生产菌种的改良DNA重组实例：天冬酰胺酶II在大肠杆菌中的高效表达(viii)菌种的筛选与鉴定：高效原核表达载体pBV220本身带有抗氨苄的基因，而DH5α本身不抗氨苄。如果载体转入菌中，那么它也就带了抗氨苄的基因。在含有氨苄青霉素的LB培养基上就能生长，未转入的就不行。第七十七页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第三节工业微生物菌种的衰退、复壮和保藏

一、菌种发生衰退的现象1.定义菌株生产性状的劣化或有些遗传标记的丢失称为菌种的退化。2.现象①菌落形态、细胞形态和生理等多方面的改变，如菌落颜色的改变，畸形细胞的出现等；②菌株生长变得缓慢，产孢子越来越少直至产孢子能力丧失；③菌种的代谢活动，代谢产物的生产能力或其对寄主的寄生能力明显下降。第七十八页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第三节工业微生物菌种的衰退、复壮和保藏

二、菌种发生衰退的原因1.根本原因菌种退化的根本原因是有关基因的负突变。2.直接原因①一般而言，菌种的退化是一个从量变到质变逐步演变的过程。因此，突变在数量上的表现依赖于传代。②连续传代，使得菌种经常处于旺盛的生长状态，而细胞的代谢水平与基因突变关系密切，因此其发生突变的机率比处于休眠状态的细胞大得多。菌种的连续传代。第七十九页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第三节工业微生物菌种的衰退、复壮和保藏

三、防止菌种发生退化的措施1.菌种分离使用单细胞分离的方法，从退化的菌株中筛选出性能优良的单细胞菌落。2.菌种的复壮分为广义的和狭义两种复壮。狭义的复壮就是对衰退菌种的分离，属于被动措施；广义的复壮则是在菌种尚未衰退之前就有意识的进行纯种分离和生产性能的测定，筛选正突变的菌种，属于积极的措施。第八十页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第三节工业微生物菌种的衰退、复壮和保藏

三、防止菌种发生退化的措施2.菌种的复壮复壮方法：(a)纯种分离(b)通过寄主进行复壮如杀螟杆菌(c)淘汰已衰退个体如5406菌种3.提供良好的环境条件(a)选用合适的培养基(b)控制传代次数第八十一页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第三节工业微生物菌种的衰退、复壮和保藏

三、防止菌种发生退化的措施4.优良的保藏方法(1)保藏方法：斜面冰箱保存法、砂土管保存法、真空冷冻干燥保存法、干孢子保存法、液氮超低温保藏法等(2)保藏原理：用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。第八十二页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第三节工业微生物菌种的衰退、复壮和保藏

三、防止菌种发生退化的措施4.优良的保藏方法(3)菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM)成立普通、农业、工业、医学、抗生素和兽医等微生物学有关的六个菌种保藏管理中心普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)中国科学院微生物研究所，北京(AS)：真菌、细菌。

中国科学院武汉病毒研究所，武汉(AS-IV)：病毒。农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)中国农业科学院土壤肥料研究所，北京(ISF)第八十三页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第三节工业微生物菌种的衰退、复壮和保藏

三、防止菌种发生退化的措施4.优良的保藏方法(3)菌种保藏机构：工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)中国食品发酵工业科学研究所，北京(IFFI)医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)中国医学科学院皮肤病研究所，南京(ID)：真菌。

卫生部药品生物制品鉴定所，北京(NICPBP)：细菌

中国医学科学院病毒研究所，北京(IV)：病毒。第八十四页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第三节工业微生物菌种的衰退、复壮和保藏

三、防止菌种发生退化的措施4.优良的保藏方法(3)菌种保藏机构：抗生素菌种保藏管理中心(CACC)

中国医学科学院抗菌素研究所，北京(IA)四川抗菌素工业研究所，成都(SIA)华北制药厂抗菌素研究所，石家庄(IANP)兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC

农业部兽医药品监察所，北京(CIVBP)第八十五页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第三节工业微生物菌种的衰退、复壮和保藏

三、防止菌种发生退化的措施4.优良的保藏方法(3)菌种保藏机构：国外著名菌种保藏机构

美国标准菌种收藏所(ATCC)，美国马里兰州

冷泉港研究室(CSH)，美国纽约

国立卫生研究院(NIH)，美国马里兰州

国立标准菌种收藏所(NCTC)，英国伦敦

日本东京大学应用微生物研究所(IAM)，日本东京

发酵研究所(IFO)，日本大阪世界卫生组织(WHO)第八十六页，共九十六页，编辑于2023年，星期日第四节种子的扩大培养

一、种子扩大培养的任务1.定义种子扩大培