工业微生物的菌种选育演示文稿

工业微生物的菌种选育演示文稿当前第1页\共有57页\编于星期五\8点优选工业微生物的菌种选育当前第2页\共有57页\编于星期五\8点三、菌种选育的目的1、提高发酵产量2、改进菌种的性能3、产生新的发酵产物4、去除多余的组分第一节概述当前第3页\共有57页\编于星期五\8点（一）菌种选育的理论基础（二）突变诱发的过程四、菌种选育的基本理论第一节概述当前第4页\共有57页\编于星期五\8点（一）菌种选育的理论基础遗传和变异

基因突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。当前第5页\共有57页\编于星期五\8点前突变：诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改变称为前突变。影响前突变产生的的因素细胞对诱变剂的透性细胞质和酶的影响基因所处的状态1、前突变形成（二）突变诱发的过程当前第6页\共有57页\编于星期五\8点

1）光复活作用

2）切补修复

3）重组修复

4）SOS修复系统（多数诱变来源于此）

5）DNA多聚酶的校正作用2、DNA损伤的修复（二）突变诱发的过程当前第7页\共有57页\编于星期五\8点（二）突变诱发的过程当前第8页\共有57页\编于星期五\8点（二）突变诱发的过程当前第9页\共有57页\编于星期五\8点SOS修复系统

它允许新生的DNA链越过胸腺嘧啶二聚体而生长。其代价是保真度的极大降低，这是一个错误潜伏的过程。

（二）突变诱发的过程当前第10页\共有57页\编于星期五\8点校正差错：光复活作用、切补修复引起差错：重组修复、SOS修复系统。3、从前突变到突变（二）突变诱发的过程当前第11页\共有57页\编于星期五\8点表型迟延：表型的改变落后于基因型的改变分离型迟延(基因杂合)经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态，突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态时，其性状才得以表达。生理性迟延

新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来。4、从突变到突变型（二）突变诱发的过程当前第12页\共有57页\编于星期五\8点从菌种保藏中心购买育种从自然界中筛选诱变杂交育种基因工程育种四、菌种来源第一节概述当前第13页\共有57页\编于星期五\8点CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter）成立于1979年，是以提供专业技术服务为主的公益性机构，1995年获得布达佩斯条约国际保藏中心的资格，是我国唯一同时提供一般菌种资源服务和专利生物材料保存的国家级保藏中心。中心设立在中国科学院微生物研究所。

当前第14页\共有57页\编于星期五\8点当前第15页\共有57页\编于星期五\8点一、定义二、方法三、特点及应用第二节自然选育当前第16页\共有57页\编于星期五\8点自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。自发突变：就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。一、定义多因素低剂量的诱变效应互变异构效应第二节自然选育当前第17页\共有57页\编于星期五\8点二、菌种自然选育方法单菌落分离法菌种单细胞悬液琼脂板分离挑取单菌落测定生产能力细菌：转种到新鲜肉汤培养基中培养放线菌、霉菌：石英砂震荡打散孢子，棉花或滤纸过滤第二节自然选育当前第18页\共有57页\编于星期五\8点三、特点及应用简单易行、自发突变的效率低。纯化菌种，防止菌种衰退、稳定产量和提高产量第二节自然选育当前第19页\共有57页\编于星期五\8点1、目前生产用菌种的特点多为人工诱变而来。代谢调控系统失控。生活力比野生菌株弱。容易发生变异。菌种衰退原因的分析当前第20页\共有57页\编于星期五\8点2、菌种遗传特性的改变1）异核现象--导致菌种这一微生物群体发生变异2）自发突变3）回复突变或产生分离子--形成具有不同基因型的个体异核体孢子遗传特性和生长速度不同菌种遗传特性发生改变相邻菌丝细胞吻合回复突变：突变基因再次发生突变又恢复原来的基因，这类突变称为回复突变。当前第21页\共有57页\编于星期五\8点1）一个菌种不是纯一的群体。3、菌种生理状态的改变2）培养基营养成分的影响3）某些培养条件下，某些基因所处的状态不同，使得菌种的生理状态不同。主要是因为培养条件不适当。当前第22页\共有57页\编于星期五\8点一、定义及特点二、诱变剂三、诱变育种的主要环节第三节诱变育种当前第23页\共有57页\编于星期五\8点第三节诱变育种诱变育种：通过诱变剂处理提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，然后采用简便、高效的筛选方法，从中选出具有优良特性的变异菌株的方法。特点：速度快、收效大、方法简便，但缺乏定向性。一、定义及特点当前第24页\共有57页\编于星期五\8点第三节诱变育种物理诱变剂：射线如紫外线、X-射线、γ-射线，快中子；化学诱变剂：氮芥、化学因子如碱基类似物、5-氟尿嘧啶、亚硝酸、亚硝基胍等。生物诱变剂：溶原性噬菌体，人工构建的质粒、转座子二、诱变剂当前第25页\共有57页\编于星期五\8点第三节诱变育种突变的诱发↓突变株的筛选↓突变高产基因的表现当前第26页\共有57页\编于星期五\8点1.出发菌株的选择2.诱变处理3.筛选4.突变菌株高产基因的表达第三节诱变育种三、诱变育种的主要环节当前第27页\共有57页\编于星期五\8点选择纯种菌株（排除异核体）优良性状的菌株（产生孢子、生长速度）对诱变剂敏感的菌株同时选择几株不同的优良菌株1.出发菌株的选择当前第28页\共有57页\编于星期五\8点1）选择原则不稳定菌株→温和的、常用的诱变剂；稳定菌株→强烈的、不常用的、诱变谱广的诱变剂不经常使用一种诱变剂，也不宜频繁更换。注意考虑诱变剂本身的特点。

UV→DNA的嘧啶碱基；亚硝酸→嘌呤碱基2.诱变处理当前第29页\共有57页\编于星期五\8点高剂量：致死率90%-99.9%变异幅度大，但负变株多低剂量：致死率75%-80%负变株少，且突变菌株稳定2）诱变剂量的选择当前第30页\共有57页\编于星期五\8点3.筛选根据步骤可以分为初筛和复筛初筛菌株的量要大，发酵和测试的条件都可粗放些，采用一个菌种进一个摇瓶的方法进行初筛复筛对发酵和测试条件要求应逐步提高，复筛一般每个菌株进3~5个摇瓶，如果生产能力继续保持优异，再重复筛选几次。初筛和复筛均要有亲株作对照比较生产能力是否优良。复筛后的优良菌株要考查其稳定性、菌种特性和最适培养条件当前第31页\共有57页\编于星期五\8点根据操作方法可分为随机筛选和理性化筛选

随机筛选

理性化筛选从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如营养缺陷型、抗性突变株等。经过诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，筛选高产菌株当前第32页\共有57页\编于星期五\8点

1）摇瓶筛选法

单菌落→传种斜面→模拟发酵瓶→测定发酵能力

2）琼脂块筛选法

打孔取块→鉴定平板测定发酵能力→(须经摇瓶复筛)随机筛选当前第33页\共有57页\编于星期五\8点3）筛选自动化和筛选工具微型化当前第34页\共有57页\编于星期五\8点96孔板高通量孵育筛选当前第35页\共有57页\编于星期五\8点营养缺陷型菌株筛选理性化筛选

所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定种类的有机物质后才能生长。当前第36页\共有57页\编于星期五\8点1）筛选用培养基⑴基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基；常以‘[-]’表示；⑵在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基，常用‘[+]’表示；⑶在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基，称为补充培养基，补充培养基可按所加入营养成分相应地用‘[A]’、‘[B]’等来表示。当前第37页\共有57页\编于星期五\8点2）营养缺陷型菌株筛选的一般方法

（1）诱变剂处理（2）淘汰野生型菌株①抗生素法②菌丝过滤法（3）检出营养缺陷型（4）鉴定营养缺陷型当前第38页\共有57页\编于星期五\8点检出营养缺陷型①夹层培养法

②限量补充培养法

③影印接种法

④

逐个检出法

当前第39页\共有57页\编于星期五\8点将突变菌株放到完全致死的环境中，一次性筛出抗性突变株。包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体

①抗生素抗性突变：提高产量；

②抗噬菌体突变：消除噬菌体污染；③条件抗性突变：如温度，可提高产量；抗性突变株筛选当前第40页\共有57页\编于星期五\8点培养基发酵条件4.突变菌株高产基因的表达当前第41页\共有57页\编于星期五\8点制备菌悬液细菌要处于对数生长期，此时，生长状态同步，生理活性一致，细胞浓度较高。霉菌、放线菌要用孢子。保证菌悬液均匀用玻璃珠振荡，使细胞均匀分散。维持一定的细胞浓度真菌和酵母一般是106-107个/毫升，放线菌和细菌是108个/毫升。举例（紫外线育种）当前第42页\共有57页\编于星期五\8点诱变单细胞悬液放置于培养皿中，放入无菌搅拌子。将培养皿置于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器和培养皿盖，打开紫外灯，计时。培养达到要求时间后，盖上培养皿盖，在红外灯下稀释分离，涂平板，用黑布包扎，在适当温度下培养。诱变最有效的波长是260nm左右（253－265nm），紫外灯的功率为15W，距离固定在30cm左右。当前第43页\共有57页\编于星期五\8点一、定义和特点二、原理三、常规的杂交育种：准性生殖方式杂交四、原生质体融合技术第四节杂交育种技术当前第44页\共有57页\编于星期五\8点杂交育种一般是指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。一、定义和特点定向杂交后对诱变剂敏感—消除诱变效应饱和改变产品质量和产量操作复杂，技术要求高，推广和应用受限特点当前第45页\共有57页\编于星期五\8点

将两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组（generecombination）。二、原理1.理论基础－基因重组2.重组与杂交的关系重组→分子水平，杂交→细胞水平杂交中必然包含着重组；重组则不限于杂交这一形式。当前第46页\共有57页\编于星期五\8点

(一)遗传标记

所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定种类的有机物质后才能生长。

营养标记菌株（营养缺陷型菌株）是最常用的遗传标记之一。三、常规的杂交育种当前第47页\共有57页\编于星期五\8点(二)异核体形成当前第48页\共有57页\编于星期五\8点(三)杂合二倍体的形成*提高异核二倍体的培养温度*用紫外线照射异核体特点：体积、DNA含量明显大于直接亲本；具有较高的酶活性，生长速率和糖的利用率较快。提高异核体形成杂合二倍体的常用方法：当前第49页\共有57页\编于星期五\8点（四）重组1染色体交换发生在体细胞的有丝分裂过程中。特点：形成的两个子细胞仍为双倍体细胞，但基因型不同。2染色体单倍化当前第50页\共有57页\编于星期五\8点基因重组甲

生长快、产量低乙生长慢、产量高生长快、产量高应用

当前第51页\共有57页\编于星期五\8点

面包酵母:对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生CO2多，生长快；

酒精酵母:产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱

杂交:就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。当前第52页\共有57页\编于星期五\8点四、原生质体融合用脱壁酶处理，将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用聚乙二醇（PEG）促进原生质体融合，从而获得异核体或重组子，这一技术叫原生质体融合。当前第53页\共有57页\编于星期五\8点（一）原生质体融合育种步