生物选修三第一章基因工程的原理和技术

生物选修三第一章基因工程的原理和技术第一页，共五十二页，编辑于2023年，星期日基因工程的基本操作步骤：1、获得目的基因2、形成重组DNA分子3、将重组DNA分子导入受体细胞4、筛选含有目的基因的受体细胞5、目的基因的表达第二页，共五十二页，编辑于2023年，星期日一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________请举出三个以上的例子2、获取目的基因的方法（1）、从基因文库中获取目的基因。（2）、化学合成例:利用PCR技术扩增目的基因----适用于目的基因的序列为未知的----适用于目的基因的序列为不是很大且已知的第三页，共五十二页，编辑于2023年，星期日获取目的基因的方法1）鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶载入受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离受体细胞(直接分离法)第四页，共五十二页，编辑于2023年，星期日2）反转录法：

目的基因的mRNA单链DNA双链DNA(即目的基因)反转录合成(人工合成法)获取目的基因的方法第五页，共五十二页，编辑于2023年，星期日3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成(人工合成法)获取目的基因的方法第六页，共五十二页，编辑于2023年，星期日总结:如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。

如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA

基因翻译产物蛋白质等特性。第七页，共五十二页，编辑于2023年，星期日一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________请举出三个以上的例子2、获取目的基因的方法（1）、从基因文库中获取目的基因。（2）、化学合成例:利用PCR技术扩增目的基因----适用于目的基因的序列为未知的----适用于目的基因的序列为不是很大且已知的第八页，共五十二页，编辑于2023年，星期日

KaryB.MullisPCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。第九页，共五十二页，编辑于2023年，星期日(2)利用PCR技术扩增①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、

_______________、___________、___________.前提条件：②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制模板(已知基因的核苷酸序列)四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物第十页，共五十二页，编辑于2023年，星期日⑥过程：a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链第十一页，共五十二页，编辑于2023年，星期日PCR原理第十二页，共五十二页，编辑于2023年，星期日PCR原理１变性第十三页，共五十二页，编辑于2023年，星期日PCR原理１退火第十四页，共五十二页，编辑于2023年，星期日PCR原理１延伸第十五页，共五十二页，编辑于2023年，星期日PCR原理２变性第十六页，共五十二页，编辑于2023年，星期日PCR原理２退火第十七页，共五十二页，编辑于2023年，星期日PCR原理２延伸第十八页，共五十二页，编辑于2023年，星期日PCR原理３变性第十九页，共五十二页，编辑于2023年，星期日PCR原理３复性第二十页，共五十二页，编辑于2023年，星期日PCR原理３延伸第二十一页，共五十二页，编辑于2023年，星期日

PCR反应曲线第二十二页，共五十二页，编辑于2023年，星期日

PCR反应曲线

理论上，PCR反应产物呈指数增长，但这种增长形式在扩增25-30个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台。此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。第二十三页，共五十二页，编辑于2023年，星期日人工合成：若基因_____，核苷酸序列又

______，则可用此法。较小已知第二十四页，共五十二页，编辑于2023年，星期日①用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。②用_____________切断目的基因，使其产生_________________。2、形成重组DNA分子③将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同第二十五页，共五十二页，编辑于2023年，星期日表达载体应包括：启动子目的基因终止子标记基因转录的起点转录的终点第二十六页，共五十二页，编辑于2023年，星期日3、将重组DNA分子导入受体细胞将目的基因导入植物细胞方法将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞基因工程的受体细胞有哪些？如何选择？如何导入？第二十七页，共五十二页，编辑于2023年，星期日3.不同受体细胞导入的方法不同：（1）植物细胞：农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法基因枪第二十八页，共五十二页，编辑于2023年，星期日农杆菌转化法农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。第二十九页，共五十二页，编辑于2023年，星期日农杆菌转化法农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。

第三十页，共五十二页，编辑于2023年，星期日基因枪法：将直径4um的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡，然后用基因枪将这些粒子打入细胞、组织或器官中，具有一次处理多个细胞的优点，但转化效率较低，另外这种方法也用于基因治疗和抗体制备，并已取得初步成效。这一方法是依靠一种基因枪来帮助导入外源基因。基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。它具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用低等优点。对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。

第三十一页，共五十二页，编辑于2023年，星期日花粉管通道法:在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。第三十二页，共五十二页，编辑于2023年，星期日（2）动物细胞：显微注射法在显微镜下，用一根极细的玻璃针(直径1～2微米)直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔，使用这种方法进行外源基因整合成功率约为10％第三十三页，共五十二页，编辑于2023年，星期日显微注射法:

动物转基因技术。在显微镜下，用一根极细的玻璃针(直径1～2微米)直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔，使用这种方法进行外源基因整合成功率约为10％第三十四页，共五十二页，编辑于2023年，星期日（3）以大肠杆菌为受体细胞：将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性感受态细胞大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源DNA,处于这种状态的细胞即感受态细胞常以微生物作为受体细胞的原因：

繁殖快、结构简单第三十五页，共五十二页，编辑于2023年，星期日感受态细胞大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源DNA,处于这种状态的细胞即感受态细胞（competentcells）。感受态细胞的用途光泛，可应用于基因重组、基因建库、基因克隆等领域。海基生产的感受态细胞是采用大肠杆菌经特殊工艺处理得到的，可用于DNA的化学转化，转化效率达到108-109cfu/μg质粒，不仅可以转化质粒，而且非常适合于转化普通的连接产物，特别适合于平端连接等需要高转化效率的转化要求。第三十六页，共五十二页，编辑于2023年，星期日通过标记基因，进行筛选和检测导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。4、筛选含有目的基因的受体细胞怎样进行检测？举例说明第三十七页，共五十二页，编辑于2023年，星期日检测—①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质鉴定——抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交抗原抗体杂交5、目的基因的检测和表达个体水平的检测：

性状的表达分子水平的检测：第三十八页，共五十二页，编辑于2023年，星期日核酸分子杂交技术：

具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链探针(序列已知，单链)待测核苷酸序列(单链)第三十九页，共五十二页，编辑于2023年，星期日变性复性DNA-DNA杂交双链分子关键步骤：变性—杂交（复性）--检测信号—结论

信号的采集与处理结论第四十页，共五十二页，编辑于2023年，星期日DNA分子杂交示意图两种生物的DNA单链之间互补程度越高，通过分子杂交形成双螺旋片段的程度也就越高，二者的亲缘关系就越近；反之，亲缘关系就越远。所以，可以通过DNA分子杂交技术来鉴定物种之间亲缘关系的远近。

。第四十一页，共五十二页，编辑于2023年，星期日检测—①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质鉴定——抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交抗原抗体杂交5、目的基因的检测和表达个体水平的检测：

性状的表达分子水平的检测：第四十二页，共五十二页，编辑于2023年，星期日用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。通过基因工程得到抗虫棉，怎样证明抗虫基因已经在棉花细胞中表达？第四十三页，共五十二页，编辑于2023年，星期日总结：基因工程的操作流程及要点第四十四页，共五十二页，编辑于2023年，星期日筛选含有目的基因的受体细胞四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因某研究所的研究人员将生长激素基因通过质料介导进入大肠杆菌细胞内，以表达产生生长激素。已知质粒中存在两个抗性基因，如图所示。目的基因不插入到氨苄青霉素抗性基因中，而大肠杆菌不带有任何抗性基因。如何筛选含有生长激素基因的大肠杆菌？第四十五页，共五十二页，编辑于2023年，星期日第四十六页，共五十二页，编辑于2023年，星期日1为了培育节水高产品种，科学家将大麦中与抗旱节水有关的基因导入小麦，得到转基因小麦，其水分利用率提高了20%。这项技术的遗传学原理是A．基因重组B．基因突变C．基因复制D．基因分离巩固练习【答案：A】第四十七页，共五十二页，编辑于2023年，星期日2利用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因培育的抗虫棉是否成功，最好检测A．是否有抗生素产生B．是否有目