蛋白质组学题

破译人类全部遗传信息。与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。1功能基因组学的主要研究内容.基因功能的研究：生物化学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径；发育上功能，如参与形态建成等。采用的手段包括经典的减法杂交，差示筛选，cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等，但这些技术不能对基因进行全面系统的分析。新的技术应运而生，包括：基因表达的系统分析.基因组的表达及时空调控功能的研究.基因组多样性的研究5功能基因组学研究中常用的新方法.转基因和基因剔除,基因诱变及突变体的PCR筛选,表达谱基因芯片.RNA干扰.基因表达的系列分析(SAGE).蛋白质组学.生物信息学2条件性基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。目前多采用Cre-loxP重组系统(Cre-loxP-mediatedgenereplacement,Cre-loxPrecombinationsystem)。其中Cre重组酶来源于侵染大肠杆菌P1噬菌体。分子量38000，无论在大肠杆菌体内或体外，它都能启动DNA分子间或分子内的联合与重组，重组发生在一个被称为loxP的特异位点(loxpsite)，且不需要其他的蛋白质因子。DNA上的遗传信息先转录成mRNA，在rRNA和tRNA的参与下，将信息再翻译成蛋白质。这就是遗传学中的“中心法则”。4是指对蛋白质间、蛋白质与DNA/RNA间的相互作用的研究。以细胞内与某个功能有关的或某种跳进下的一群蛋白质为主要研究内容，由此建立细胞内外信号传递的复杂网落。21蛋白质组与基因组相比自身的特点是什么？多变与稳定；无限与有限；三维信息与一维信息；研究对象分别为生物整体和生物组成元件，例如DNA；蛋白质组学研究部不同于传统蛋白质的研究，重在与生命活动相关的动力学、细胞通路中的蛋白质复合物等；蛋白质的结构还是由基因来决定的。因此蛋白质组的研究与基因组的研究存在着相辅相成的关系。、5目前，蛋白质组学的主要研究方法X-ray衍射技术二维电泳3,质谱7蛋白质组研究中的样品制备通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分，分别进行蛋白质组研究。第一节蛋白质样品制备的基本方法22蛋白质样品的制备的基本方法有那几个步骤一、 细胞的破碎裂解二、 制备蛋白质样品常用的缓冲液三、 离液剂、还原剂、表面活性剂及蛋白酶抑制剂的选择四、 蛋白质的沉淀与浓缩五、 蛋白质的定量六、 样品污染物的去除8样品预分级的主要方法包括根据蛋白质溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的蛋白质成分。通过对样品进行预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。24细胞的破碎裂解(一)温和的裂解方法渗透溶解法2.冻融裂解3.表面活性剂裂解4.酶溶法(二)猛烈的细胞破碎方法1.超声波处理2压力杯法33.研磨法4.机械匀浆法5玻璃珠匀浆法6影响电泳分离效果的因素1)待分离生物大分子的性质待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。(2)缓冲液的性质缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响，溶液pH值离等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。电场强度电场强度(V/cm)是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。电渗液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。10温和破碎法11染色方法：1胶体考马斯亮蓝染色2胺基黑染色转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色3银染4负染主要包括金属盐染料、锌一咪唑5胶体扩散染料。主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等6有机荧光团染料7金属螯合染料23双向电泳（twodimensionalelectro-phresis,2-DE）原理：根据蛋白质的两个一级属性（等电点和分子量），将一种蛋白质样品进行两次电泳，即：在第一个方向上按等电点高低进行分离；在第二个方向上（与第一次电泳成直角的方向）按分子量大小进行分离。27样品制备缓冲液的配制IPG条（是双向电泳中的第一向分离场所）重泡涨及上样第一向：IEFIPG条平衡平衡缓冲液I（还原）平衡缓冲液11（巯烷基化）第二向：SDS胶条染色:考马斯亮兰或P银染进行检测成像及图像分析:Pdquest等软件25在蛋白质抽提过程中，有几条共同的原则需要遵循：一是尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的非共价键结合，使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在；二是避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用；三是避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用，四是蛋白质样品与第一向电泳的相容性。9样品的类型1.整体样品是生物个体小的物种（如微生物），可以整体取样。组织样品有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。细胞样品包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长的细胞、周期性细胞样品(如红细胞、淋巴细胞)和从组织中分离同类的细胞样品。可溶性样品是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。13研究蛋白质相互作用的常用方法酵母双杂交(yeasttwohybridization)亲和层析免疫共沉淀蛋白质交联基于GFP(绿色荧光蛋白)的细胞内蛋白质相互作用的研究方法噬菌体显示系统筛选12蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。28特点：1.能用于分析高极性、难挥发和热不稳定性生物大分子。ESI-MS可以和液相色谱、毛细管电泳等现代化的分离手段联用MALDI-TOF-MS对盐和添加物的耐受能力高，且测样速度快，操作简单。快速、准确、灵敏、高通量等特征，这些特征符合对蛋白质和核酸的分析要求。原理：质谱的基本原理是基于带电粒子在磁场或电场中运动的轨迹和速度依粒子的质荷比M/Z的不同而变化，从而可以据其差别来判断粒子的质量及特性。结构：通常质谱仪包括离子源，区分离子质荷比(M/Z)的质量分析器和检测器。29电喷雾电离ESI原理及特点电喷雾电离是将待测分子溶解在溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口，毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电微液滴，随着液滴中挥发性溶剂蒸发，微滴表面的电荷体密度随半径减少而增大，到达某