蛋白质含量测量方法

蛋白质含量测量方法l=J

I三mi=J

I三m从查阅的资料来看，目前测定蛋白质含量常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法(Bradford)、Folin酚试剂法。这五种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，每种方法都有其优缺点，在选择方法时应考虑:⑴实验对测定所要求的灵敏度和精确度;⑵蛋白质的性质;⑶溶液中存在的干扰物质;⑷测定所要花费的时间。一、凯氏定氮法1、实验原理蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。有机物中的胺根在强热和CuSO4,浓H2SO4作用下，硝化生成(NH4)2SO4反应式为：CuSO4+2NH2—+H2S04+2H+=(NH4)2S04在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B407+H2S04+5H20=(NH4)2S04+4H3B03(NH4)2B407+2HCl+5H20=2NH4Cl+4H3B032、操作方法样品处理:精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品(约相当氮30-40mg),移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜,6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗,将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力,并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷,小心加20ml水,放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中,再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。向接收瓶内加入10ml2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内,塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min,然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。同时吸取10.0ml试剂空白消化液按(3)操作。3、优点缺点凯氏定氮法适用范围广泛,测定结果准确，重现性好，但操作复杂费时,试剂消耗量大。二、双缩脲法(Biuret)1、 实验原理双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180°C左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。2、 操作方法标准曲线的测定:取12支试管分两组，分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(20〜25C)下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。样品的测定:取2〜3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。3、 优点缺点实验操作简便迅速，但其缺点是灵敏度较低,蛋白质量须在1~20mgPmL时测定结果较准确。双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。三、紫外吸收法1、 实验原理蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。2、 操作方法取待测样品制成蛋白浓度大约在0.1~1.0mgPmL的蛋白质溶液，用紫外分光光度计进行比色，对照标准曲线得出样品含氮量。每个样品做3次重复测定，取平均值。3、 优点缺点紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。此法测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差，故本法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌吟、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。四、考马斯亮蓝法(Bradford)1、 实验原理Bradford法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465nm变为595nm,蛋白质在1~1000ug范围内，蛋白质-色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。2、 操作方法(1)标准曲线测定法分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min,在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。具体操作见下表。蛋白质标准曲线测定加样试剂空白12345100ug/ml牛血清清蛋白/ml1.00.10.20.40.60.8牛血清清蛋白/ug01020406080去离子水/ml00.90.80.60.40.2考马斯亮蓝G-250试剂/ml5.05.05.05.05.05.0吸光值A595(2)蛋白样品配制浓度约100ug/ml的待测蛋白质溶液。取一只试管加入1.0ml蒸馏水做空白，一支加入0.5ml待测蛋白质溶液，补充水到1.0ml。然后每支试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的ug数量，计算出待测蛋白质的含量。在标准蛋白质和蛋白质样品的测定时，为了减小误差,每一个浓度的蛋白质做3支平行管。(3)试剂配置牛血清清蛋白标准液结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量或者根据牛血清清蛋白的消光系数是6.6来计算其百分含量。然后根据该蛋白的纯度配置成浓度为100ug/ml的蛋白溶液。考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml质量浓度为0.85g/ml的磷酸,作为母液保存，使用时用水稀释到1000ml。试剂的最终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250、质量浓度为0.085g/ml磷酸。3、优点缺点该法方法简便，易于操作,所用试剂较少，显色剂易于配制。干扰物质少，如糖、缓冲液、还原剂和络合剂等均不影响显色。此法的缺点是由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用Y-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。五、Folin酚试剂法1、 实验原理Folin-酚试剂法测定蛋白质含量是双缩脲法的发民，所用的试剂是由两部分组成的。第一部分相当于双缩脲试剂，第二部分为Folin-酚试剂（磷钨酸和磷钼酸混合液）。因此，反应的程序也是分两步进行的。第一步相当于双缩脲反应，在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物;第二步是基于Folin试剂（磷钼酸和磷钨酸试剂）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物（呈蓝色反应）。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸，故有此呈色反应。而且溶液颜色的深浅与蛋白质的含量成正比关系。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是25-250ug2、 操作方法（1）标准曲线的测定取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20〜25°C）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙,2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后,再放置30分钟,然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时,为了防止出错，必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序,逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。（2）样品的测定取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量,从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。3、优点缺点优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差,干扰物质较多。而且，耗费时间长，操作要严格计时，颜色深浅随不同蛋白质变化。各种蛋白质含量测定方法比较方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法灵敏度低，使用于0.2-1.0mg氮,误差为±2%费时，8-10小时，但如果采用凯氏定氮仪，缩短时间至4个小时将蛋白氮转化为氨气，然后用酸吸收滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定,干扰少，费时，如果采用凯氏定氮仪，就会大大缩短定氮时间双缩脲法灵敏度低，1-20mg中速20-30分钟多肽键+碱性Cu2+紫色络合物硫酸铵:Tris缓冲液，某些氨基酸用于快速测定，但不灵敏，不同蛋白质显色相似紫外吸收光法较为灵敏,50-100微克快速5-10分钟蛋白质中的